表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是条件致病菌，寄居于人体的皮肤和粘膜表面，主要在体内长期留置导管(如中央静脉插管、腹膜透析等)和接受人工器官(如人工关节、人工晶体和人工心脏瓣膜等)的患者中引起感染。近年来，其发病率呈日益上升的趋势。现已知道，表皮葡萄球菌的致病性与其在人造高分子材料表面形成细菌生物膜(biofilm，BF)密切相关，生物膜可以保护内部的细菌免受机体免疫应答和抗生素的杀伤作用，从而使得感染迁延不愈。本研究以具有不同生物膜表型和致病能力的2株表皮葡萄球菌为基础，采用生物信息学对基因组进行了比较分析并对分析结果进行生物学功能验证；同时对蛋白质组比较中TRAP表达差异的结果进行了生物学验证，并对trap基因表达与表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化的相关性展开研究；对葡萄球菌双组分系统进行了初步的探讨，并选取srrB/srrA双组分系统作为研究对象进行初步研究。 第一部分表皮葡萄球菌基因组比较的生物学功能验证 在表皮葡萄球菌ATCC12228株(无生物膜形成)和ATCC35984株(生物膜形成强阳性)全基因组序列已知的基础上，我们与上海市生物信息中心合作对2株菌进行了比较基因组学分析。分析结果显示两株菌的染色体DNA同源性很高(97﹪)，ATCC35984株基因组中含有较多的重复序列和插入序列，提示稳定性较差。两株菌染色体之间存在约2.0Mb基因片断的反转，伴有部分基因的缺失，并含有10,297个单核苷酸多态性(Single-nucleotidepolymorphisms，SNPs)位点。特异性的PCR扩增和测序结果证明基因组分析的正确性。毒力因子分析显示ATCC12228株与ATCC35984株含有相似数目的致病基因，但生物学实验提示ATCC12228株的部分致病基因(AAP、TRAP、β毒素和δ毒素)在表达水平明显低于ATCC35984株，可能与致病性的差异相关。抗生素耐药的实验结果显示，ATCC35984株对青霉素、苯唑西林、红霉素、庆大霉素和阿米卡星等多种抗生素耐药，而ATCC12228株仅对青霉素和四环素耐药，与分析结果相符。 对SNPs位点引起的非同义(non-synonymous，基因突变改变编码蛋白的性状)突变与同义突变(synonymous，基因突变不改变编码蛋白的性状)比值(N/S)的研究显示毒力因子和表面蛋白基因的N/S比值明显偏离总体基因的比值，提示两者的进化较快，平行于致病环境的变化。实验结果证明非同义突变对部分基因产物的功能产生了影响：对甲硫氨酸亚砜还原酶的功能影响通过检测细菌对H2O2和paraquat(百草枯)等活性氧族(ReactiveOxygenSpecies，ROS)的抵抗力反映，结果显示不管是在不同浓度的H2O2还是在低于MIC(minimalinhibitoryconcentration，最小抑菌浓度)的百草枯作用下，ATCC35984株的抵抗力均较强；对核糖体蛋白S12的功能影响通过在低浓度链霉素作用下细菌形态的变化进行观察，革兰染色结果显示加入低浓度链霉素后ATCC12228株的颜色略偏红色，并且细胞边缘模糊，而ATCC35984株则无明显变化。这些蛋白的功能变化虽然与ATCC35984株生物膜的形成没有直接相关性，但对其致病力产生了重要的影响。此部分的研究结果提示由于致病环境的变化，使得ATCC35984株基因组在进化过程中获得了较多的致病性相关基因，从而具有较强的致病能力，并且这种进化目前仍在继续。 第二部分trap基因表达与表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化的相关性 对表皮葡萄球菌ATCC35984株和ATCC12228株对数生长中期的蛋白进行研究发现TRAP蛋白(TargetofRNAⅢ-activatingprotein，RNAⅢ活化蛋白的靶蛋白)表达存在差异。在金黄色葡萄球菌中TRAP是一个毒力和生物膜形成的调控因子，并且也是agr系统活化必需的通路蛋白，但在表皮葡萄球菌中尚未见研究报道。 我们采用实时定量PCR对表皮葡萄球菌临床株(4株生物膜阳性菌株和3株阴性菌株)trap基因和RNAⅢ(agr系统的效应子)的转录水平进行研究，并以SEl457△agr(agr系统突变株)作为阴性对照。结果显示2株生物膜阳性株trap基因的转录降低(与ATCC35984株相比分别降至0.029倍和0.322倍，p＜O.05)，而RNAⅢ转录未见降低，并且存在trap基因转录下降而RNAⅢ转录上升的现象(trap转录降至0.322倍，RNAIII转录增至4.001倍)。实验结果提示在表皮葡萄球菌中，trap基因的转录和翻译与生物膜形成及agr系统活化之间不存在一个直接的相关性。对不同生长时期trap基因和RNAⅢ转录水平的研究显示，RNAⅢ的转录随着细菌的增多而逐渐增加(荧光比值从2.83，9.05增至12.30)，在对数生长晚期达到最高，而trap基因的转录在各个时期均较低。对TRAP蛋白的同源性分析显示其是葡萄球菌的保守性蛋白，但表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌TRAP蛋白序列之间存在一个氨基酸的移位，从进化树(phylogenictree)中也可以看出两个菌种之间存在明显的进化距离，提示可能是两者功能差异的原因。 第三部分葡萄球菌双组分调控系统的生物信息学分析 鉴于双组分调控系统(Two-componentsystem，TCS)对葡萄球菌重要的调控作用，我们对葡萄球菌的双组分系统进行了生物信息学分析。在所研究的8株葡萄球菌基因组中(6株金黄色葡萄球菌和2株表皮葡萄球菌)均存在16或17对双组分系统，这些双组分系统的G+C含量与基因组相近，在基因组中均匀分布，参与调控多种重要的生物功能。对双组分系统组氨酸蛋白激酶(histidinekinase，HK)和反应调节蛋白(responseregulator，RR)的功能域进行分析，得到了4组HK和5组RR。HATPasec功能域和REC功能域分别是葡萄球菌HK和RR的标志，其余HisKA、PAS、HAMP、GAF、KDP、5TM-5TMRLYT和各类DNA结合功能域也存在于葡萄球菌的HK和RR中。对葡萄球菌HK进一步根据ForstS提出的标准进行分类，发现可以归为Ⅰ-Ⅳ类(无CheA类)，Ⅰ类是最主要的一类，与其他革兰阳性菌的观察结果相符。在葡萄球菌RR中，3个保守性残基Asp、Gly和Lys的同源性较高，存在于所有RR中。金黄色葡萄球菌典型双组分系统与主要毒力因子关系示意图显示其可以对多种毒力因子发挥调控作用，组成了复杂的交互调节网络。但是在表皮葡萄球菌中对此研究较少，值得我们进一步探讨。 第四部分表皮葡萄球菌srrB/srrA双组分调控系统的研究 根据上述对双组分系统的分析得知在金黄色葡萄球菌中srrB/srrA(staphylococcalrespiratoryresponse)双组分系统的作用是调节毒力因子分泌和呼吸代谢，因此我们选择在表皮葡萄球菌中对srrB/srrA进行研究，希望可以通过序列的分析和缺失突变株的构建而研究其调控网络以及对细菌表型的影响。 对表皮葡萄球菌1457株srrA和srrB基因的分析显示其与金黄色葡萄球菌同源性很高，分别为90﹪和69.9﹪。通过基因序列和位黄的比较确定了表皮葡萄球菌srrA基因的TATA盒、RBS(Ribosomebindingsequence，核糖体结合序列)以及srrB基因的RBS。对SRRA和SRRB蛋白的功能域分析发现两者均具有双组分系统典型的功能域。并且在转录水平上也检测到了转录活性。但是在构建srrB/srrA缺失突变株却未获得成功，所得到23个重组抗性突变株并不是在目的基因srrA和srrB处发生同源重组。失败的原因可能是基因组中较多重复序列(repeat)的干扰。在下一步的研究中，将尝试单独敲除srrA或srrB基因以及从蛋白方面继续对这对双组分系统进行研究。 综上所述，本研究通过对表皮葡萄球菌基因组和蛋白质组比较分析的部分结果进行生物学实验验证和进一步的研究，所得出的结果及提出的假设对深入研究表皮葡萄球菌生物膜形成及致病性的分子机制具有重要的意义，并为诊断、治疗表皮葡萄球菌的相关感染奠定了一定的基础。