细菌对抗菌药物耐药性的不断加剧严重威胁着公众健康,这是全世界共同关注的重大问题。尤其是鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌以及铜绿假单胞菌,对所有常规使用抗生素全耐药菌株的出现,使临床医生处于无药可选的困境。更为严峻的是,目前处于临床试验阶段的新抗菌药物种类非常有限,其中大多数仍是对传统药物的结构修饰物。新型抗生素的研发远远落后于细菌耐药性的变异。人们意识到,抗生素治疗细菌感染的时代已接近终点,寻找新的治疗手段势在必行。噬菌体以其杀菌特异性强,、自然资源丰富、无毒无害以及易于生产和工程改造等优点,为人类开发新型抗菌药物提供有效手段。然而,用噬菌体防治细菌感染就必须先从环境中分离筛选到能高效杀灭各种致病菌的噬菌体,并对这些噬菌体的生物学特性进行研究,这是决定噬菌体治疗成败的基础和前提。鲍曼不动杆菌是引起医院内感染的重要病原菌,因其耐药性日趋严重,甚至已出现“全耐药”菌株而受到国内外的广泛关注。但目前国内外对鲍曼不动杆菌噬菌体的研究却非常有限。本文采用鲍曼不动杆菌临床分离株为宿主菌,从环境中成功分离到一株全新的能够高效裂解此菌的噬菌体,命名为ZZl。本文目的是研究噬菌体ZZ1的生物学特性,包括基因组测序和全基因组生物信息学的分析。同时,通过观察尾静脉注射ZZ1对全身感染小鼠的治疗效果来评价其应用价值。本文为采用噬菌体制剂防治细菌感染奠定实验基础。材料与方法1鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1的分离及其生物学特性的研究采集污水样品,以鲍曼不动杆菌临床分离株为指示菌分离噬菌体；挑取单个透明噬菌斑,进行多次单斑分离以纯化噬菌体；采用液体增殖和平板固体增殖的方法增殖噬菌体ZZ1；采用PEG8000共沉淀、氯仿抽提的方法浓缩噬菌体ZZ1颗粒；采用氯化铯密度梯度离心法纯化噬菌体ZZ1颗粒；透射电镜观察噬菌体ZZ1形态；通过双层平板法测定噬菌体ZZ1效价,调查噬菌体ZZ1的噬菌谱,并用通用引物扩增16s rRNA,测序后进行Blastn比对鉴定其宿主种类,绘制噬菌体ZZ1的一步生长曲线,检测噬菌体ZZ1对温度、pH等理化因素的稳定性,测定噬菌体ZZ1杀灭其宿主菌的最佳温度范围。采用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取噬菌体ZZ1基因组；用DNase](RNase Free), RNase A (DNase Free)和HindⅢ的酶解作用鉴定基因组类型；用Covaris S220将噬菌体ZZ1DNA随机打成约500bp长的片段,T4DNA Polymerase、 Klenow Fragment以及T4Polynucleotide Kinase进行5’末端的修平和磷酸化, Klenow Fragment exo-进行3’末端加"A", T4DNA ligase连接通用接头、PCR扩增构建噬菌体ZZ1测序文库；Hiseq2000上机测序,Velvet1.2.08进行序列拼接。2鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1全基因组生物信息学分析应用GeneMarkS软件和fgenesVO软件预测ZZ1的蛋白编码区；采用本地BlastP对所预测到的基因进行功能预测,利用Batch CD-search预测蛋白保守区；用ProtParam tool预测ZZ1蛋白的分子量和等电点；用DNAStar Lasergene7.1软件预测ZZ1基因的GC含量；用在线软件TMpred预测蛋白跨膜区；用Mauve2.2.0和CoreGenes3.5分别在核酸水平以及蛋白水平进行全基因组比较分析；用GenSkew分析ZZ1基因组GC偏移和预测复制起点；用tRNAscan-SE1.21和ARAGORN进行tRNA预测,Blastn对预测的tRNA进行相似性比对；密码子偏嗜性分析采用EMBOSS (6.2.0)软件包中的CUSP和CAI程序。3鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1体内失活因素及体外筛选体内具抗菌活性噬菌体方法的建立及其初步评价调查小鼠体内影响噬菌体ZZ1活性的因素,包括采用噬菌斑减少中和试验检测小鼠血清中是否存在能中和噬菌体ZZ1的天然抗体；观察分析噬菌体ZZ1在小鼠体内的药代动力学,明确网状内皮系统对ZZ1活性的影响；比较噬菌体ZZ1在补体灭活血清以及补体未灭活血清中对其敏感宿主菌AB09V的杀灭作用,分析血清补体对ZZ1体内抗菌活性的影响。选择其他4株新分离到的噬菌体(F19、PG3、PG17和L2),体外实验中观察到他们分别可以特异性感染并高效杀灭4株不同的多重耐药致病菌(肺炎克雷伯菌KP-19,阴沟肠杆菌EC3,阴沟肠杆菌EC17和铜绿假单胞菌PA2)。利用血清中噬菌体的杀菌实验从这4株噬菌体中初步筛选出可能具有治疗作用的噬菌体,进一步观察血清中杀菌呈阳性的噬菌体通过尾静脉注射后对全身感染致死量其宿主菌的小鼠的治疗效果,初步评价血清中噬菌体杀菌实验筛选体内具抗菌活性噬菌体方法的效果。结果1鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1的生物学特性噬菌体ZZ1在鲍曼不动杆菌AB09V的菌苔上形成直径为1-2mm的透明噬菌斑,表现出裂解性噬菌体的噬斑特征；透射电镜观察显示ZZ1有一个较长的二十面体立体对称的头部(约100nm长80nm宽)和一个可以伸缩的尾部(约120nm长),此为有尾噬菌体目肌尾病毒科噬菌体的典型形态；噬菌谱调查结果显示ZZ1对本研究涉及的非鲍曼不动杆菌无裂解作用,仅对23株鲍曼不动杆菌中的3-株显示裂解作用,在相同培养条件下,这3株宿主菌对ZZ1的敏感程度由大到小依次为AB09V.AB0901和AB0902。一步生长曲线显示ZZ1感染AB09V后其潜伏期约为9min,爆发量约200PFU/细胞。理化因素稳定性实验结果表明,ZZ1可以耐受较宽的酸碱环境(pH4-9)以及50℃和60℃范围的较高温度。噬菌体ZZ1在35℃～39℃均可保持稳定的最佳抗菌活性,噬菌体ZZ1的基因组核酸不能被RNase A (DNase Free)降解,但可被]DNasel (RNase Free)和HindⅢ降解,因此其基因组核酸类型为dsDNA。对构建好的噬菌体ZZ1基因组测序文库进行双端测序获得总的读长数目为937,400个,平均读长为250bp,最后应用velvet软件拼接出一条长为166,801bp的噬菌体基因组,其两端带有114bp的重复序列。2鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1全基因组生物信息学分析ZZ1基因组非重叠序列全长166,687bp,平均GC含量为34.4%,低于鲍曼不动杆菌GC含量(38.9%～39.2%)；ZZ1基因组共预测到256个CDS和8个tRNA,基因组平均每lkb编码1.5个基因,基因密度约为93.6%,基因长度范围为34aa～1303aa,平均203aa。256个预测蛋白中,有95个(37.1%)可注释出功能,这些蛋白均是T4-like蛋白,包括36个噬菌体结构蛋白,21个参与DNA复制、重组、修复、包装和加工处理的功能蛋白,11个参与核酸代谢的蛋白,5个参与噬菌体装配调节的蛋白,7个参与转录的蛋白,3个参与翻译的蛋白,3个参与裂解宿主菌的蛋白,5个参与关闭或改变宿主菌代谢的蛋白,2个参与细菌与噬菌体相互作用的蛋白,其余2个为移动元件。在161个功能未知的ZZ1预测蛋白中,有37个具有跨膜区,有23个具有保守的结构域。其中ZZ1的CDS011被预测出属多重耐药超家族,其编码的蛋白具有四个跨膜区。此外,在ZZ1的基因组中并未发现其他耐药基因和毒力因子。噬茵体ZZ1与GenBank中其他4株不动杆菌属噬菌体(Acj9、Acj61、Ac42和133)以及大肠杆菌噬菌体T4的比较基因组学研究揭示出11组不同长度的局部同线块(local colinear block, LCB),其中有7组LCB (>10kb)为6株噬菌体所共有。BlastP和CoreGenes分析显示：ZZ1的预测蛋白中有110个(占总基因数的43%)与T4蛋白具有显著相似性(Evalue<10-6); ZZ1与Acj9、Acj61、133以及Ac42含有的同源基因总数分别为179、164、157和143个,分别占噬菌体ZZ1总预测蛋白数的69.9%、64.1%、61.3%和55.9%；这些结果表明ZZ1与这5株噬菌体有共同的祖先,因此,噬菌体ZZ1属于T4-like噬菌体家族。GC skew预测结果显示ZZ1的复制起点在nt81009,复制终点在nt1。其中复制起点与8个tRNA所在的位置非常接近；ZZ1编码tRNA的种类和数量虽与其他鲍曼不动杆菌编码的tRNA均不同,但其tRNA与他们编码的tRNA却有着不同程度的核酸序列相似性,这些高度保守的tRNA可能具有某些可通过垂直进化遗传下来的重要的生物学功能。此外,虽然ZZ1编码的tRNA有一半以上(5/8)携带的密码子是噬菌体ZZ1总蛋白高频使用的密码子,但其他4株不动杆菌属噬菌体的tRNA所携带的密码子与噬菌体本身高频使用的密码子一致的并不到总tRNA的50%。3鲍曼不动杆菌噬菌体ZZ1体内失活因素及体外筛选体内具抗菌活性噬菌体方法的建立及其初步评价噬菌体ZZ1对绝对致死量的AB09V感染小鼠无治疗效果(p>0.05)。ZZ1体内失活原因的研究调查结果显示,小鼠血清中不存在可中和噬菌体ZZ1的天然抗体,ZZ1的失活与小鼠网状内皮系统对噬菌体的清除也无直接关系,但血清补体与AB09V的相互作用完全抑制了ZZ1的吸附活性,这是导致ZZ1在小鼠体内失去抗菌活性的主要原因。因此,体外观察噬菌体在离体组织(如血清、抗凝全血、或其他组织的匀浆)中的抗菌活性可作为筛选体内具抗菌活性噬菌体的有效方法。为初步评价在离体组织中噬菌体杀菌实验筛选体内具抗菌活性噬菌体方法的效果,本实验随机选择了4株新分离到的在体外能高效杀灭其敏感宿主菌的噬菌体(F19、PG3、PG17和L2),在小鼠血清中具有杀菌作用的噬菌体共3株,分别是F19、PG3和PG17。这3株噬菌体对全身感染绝对致死量细菌的小鼠的治疗结果表明,感染小鼠1周内的存活率在F19噬菌体治疗组为100%(8/8),在PG3噬菌体治疗组为87.5%(7/8),在PG17噬菌体治疗组为87.5%(7/8)。3株噬菌体在小鼠各脏器对其敏感宿主菌的杀灭实验结果显示,噬菌体治疗组小鼠各组织脏器含活菌量与无噬菌体治疗对照组相比均有明显降低(p<0.001)。此外,热灭活噬菌体对感染小鼠均无治疗作用(存活率为0%,0/8),小鼠各组织脏器含菌量与无噬菌体治疗对照组相比也均无明显变化(p>0.05),说明小鼠各脏器活菌数的减少与噬菌体的非特异性免疫增强作用无关。这些结果均证明：3株血清中杀菌呈阳性反应的噬菌体通过尾静脉注射后对全身感染绝对致死量其宿主菌的小鼠具显著治疗效果。此结果初步证实了本研究所建立的在离体组织中噬菌体的杀菌实验筛选体内具抗菌活性噬菌体方法的有效性。结论1.噬菌体ZZ1是一株有尾噬菌体目肌尾病毒科的裂解性噬菌体。鲍曼不动杆菌AB09V是其最为敏感的宿主菌,在其菌苔上形成直径为1-2mm的透明噬菌斑,感染潜伏期为9min,爆发量为200PFU/cell; ZZ1在极端温度和极端pH的环境下具有较强的稳定性,在35℃～39℃均可显示最佳的抗菌活性。2.噬菌体ZZ1的基因组为dsDNA,全长166,687bp,平均GC含量为34.4%。含有256个CDS和8个tRNA。能够注释出功能的CDS有95个,他们大多数为病毒结构蛋白和参与DNA复制的功能蛋白。比较基因组学研究结果表明噬菌体ZZ1属于T4-like噬菌体家族。3.尾静脉注射噬菌体ZZ1对腹腔感染绝对致死量AB09V的小鼠无治疗效果；补体系统是导致ZZ1在小鼠体内失去抗菌活性的主要原因；体外观察噬菌体在离体组织中的抗菌活性可作为筛选体内具抗菌活性噬菌体的有效方法。