拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger,Pv）又名鼎突多刺蚁,隶属于蚁科（Formicidae）,多刺蚁属（Polyrhachis）,主要分布于我国云南、广西、浙江以及国外的缅甸、印度和澳大利亚等地区。拟黑多刺蚁是一类营群居性生活的社会性昆虫,此外也属于经济类昆虫。拟黑多刺蚁自身具有较大的药用及食疗价值,拟黑多刺蚁体内含蚁酸、28种氨基酸、多种维生素以及多种微量元素,其中锌的含量高达180mg/kg。有研究表明,拟黑多刺蚁在药用方面能辅助治疗乙型肝炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、神经衰弱等多种疾病。早在1993年,卫生部就将拟黑多刺蚁确定为食药两用无害的优良蚁种。近年来许多学者开展了对拟黑多刺蚁发育过程的研究,以期建立社会性昆虫系统性发育生物学研究体系,为拟黑多刺蚁的理论研究、物种保护及产业化应用奠定坚实基础。在拟黑多刺蚁发育过程中,最为重要的激素之一是蜕皮激素（Ecdysteroid hormones,EH）。该激素是拟黑多刺蚁及其他众多昆虫调控蜕皮及变态发育的重要激素。蜕皮激素在体内一般以20-羟基蜕皮酮的活性形式存在（20-hydroxyecdysone,20E）。同时,在拟黑多刺蚁发育进程中扮演重要角色的另一激素是保幼激素（Juvenile hormone,JH）,也是一种重要的内源性激素。保幼激素一般由拟黑多刺蚁咽侧体分泌,主要用于保持拟黑多刺蚁幼年时期（幼虫期）特性,防止内部器官提前出现成虫的性状分化和变态;保幼激素会在虫体临近变蛹时期相应减少或停止分泌。已有研究表明,昆虫的成虫经保幼激素处理会引起不育。在保幼激素发挥作用的信号通路调节过程中受一些关键基因及蛋白质的调控,其中Methoprene tolerant（Met）作为其他昆虫已知的保幼激素的潜在受体,在昆虫的生长发育过程中扮演重要角色。与此同时,研究人员在后续很多实验中发现一些模式昆虫中还存在着雌激素相关受体（Estrogen related receptor,ERR）,该受体同样与昆虫的生长、发育、生殖等具有密切的联系。由于昆虫发育过程关键激素与很多受体有着一定的关联,为了进一步研究清楚昆虫保幼激素的调节机制,研究人员也逐步将研究重点转移到了配体与受体结合介导的基因转录和表达的调节当中。比如,本实验所涉及的拟黑多刺蚁的两个重要基因ERR和Met所编码的蛋白质是十分重要的转录因子,参与昆虫机体内多种生理活动。早期对于ERR的相关研究主要集中于其在哺乳动物中的作用,虽然已有报道证明昆虫中也存在有ERR,但由于昆虫中没有雌激素,因此关于ERR在昆虫中的具体作用及其机理,值得进一步关注。在前期研究中,本实验室以拟黑多刺蚁为实验材料,运用分子生物学、组织化学、生理学、行为训练等相关生物学手段,系统性地研究了拟黑多刺蚁在个体繁殖、生长发育及生理活动等方面的特性及部分分子机制,为本论文实验的顺利开展奠定了坚实的前期基础。例如本实验室前期研究结果发现,拟黑多刺蚁中,ERR与蜕皮激素受体（Ecdysteroid receptor,EcR）基因之间存在相关性,表明ERR可能参与到昆虫性腺轴激素调节环路上,但关于ERR是否直接或间接参与到保幼激素信号通路中需要具体实验验证。参与到昆虫保幼激素信号通路中的关键基因除了潜在受体的基因Met外,还有Krüppel-homolog1（Kr-h1）、类固醇激素受体共激活物（Steroid receptor coactivator,SRC）等。本研究主要运用 RNA interference（RNAi）、实时定量 PCR、western blotting等技术方法探讨拟黑多刺蚁体内ERR、Met、Kr-h1、SRC四个基因之间在基因表达及功能上是否存在关联,以此探究ERR与保幼激素信号通路的功能相关性,为更好地了解拟黑多刺蚁生长发育过程奠定良好的基础。同时,这对于进一步探究昆虫中ERR的功能、了解社会性昆虫的生长发育模式具有重要意义。本研究所取得的结果如下:1.在拟黑多刺蚁体内成功克隆和鉴定了Met,Kr-h1和SRC的部分cDNA序列。经琼脂糖凝胶电泳检测上述三种基因的PCR产物,片段长度与预期一致。随后利用阳性克隆子测序,结果经Blast序列同源性比对及相关生物信息学分析可知,从拟黑多刺蚁体内克隆的Met,Kr-h1和SRC的部分cDNA序列与已知模式昆虫对应基因的同源性较高,证实了所克隆基因片段的准确性,因此定名为PvMet-h1和PvSRC。2.基于PvMet,PvKr-h1和PvSRC基因的部分cDNA序列克隆及PvERR的cDNA序列,本研究分析了这四个基因在拟黑多刺蚁2龄幼虫、4龄幼虫、蛹期、雌性成虫、雄性成虫这五个重要发育时期的mRNA水平相对表达模式。同时进一步研究了施加外源保幼激素JHⅢ之后四个基因相对表达水平变化。五个不同发育时期基因表达模式研究结果显示:（1）从2龄幼虫到成虫的发育阶段,PvERR相对表达水平随时间延长显著升高。（2）从2龄幼虫到蛹期,PvMet,PvKr-h1和PvSRC的相对表达水平随时间延长显著降低。（3）PvMet的相对表达量在2龄幼虫与雌性成虫之间无显著差异,但在雌、雄成虫体内的相对表达量存在着显著差异。（4）PvKr-h1的相对表达量在雌、雄成虫体内与2龄幼虫无显著差异。（5）PvSRC的相对表达量在雌、雄成虫体内与4龄幼虫无显著差异。在拟黑多刺蚁生长发育过程中,PvERR能够参与到20E信号通路中相关的生理调控过程,之前本实验室的相关研究已经证实这一点。而昆虫的20E与JH信号通路又具有密切的关联,可以通过介导通路中部分相同基因的表达来共同完成昆虫变态发育进程。研究结果初步表明,拟黑多刺蚁中PvERR与JH信号通路之间存在着关联性;PvERR的表达与JH信号通路中的关键基因的表达呈现负相关,恰好与已知的20E调控昆虫变态,JH控制蜕皮、保持幼虫形态的作用相符合。而本研究初步揭示了PvERR与JH信号通路也具有关联性。在对五个不同发育时期基因表达模式研究中发现,JH信号通路关键基因在4龄幼虫和蛹期的相对表达量较低,因此选择这两个发育时期进行外源JHⅢ处理1 h、6h、12h、24 h之后,继续开展PvERR,PvMet,PvKr-h1和PvSRC四个关键基因的表达模式研究。结果表明,进行外源JHⅢ处理这两个发育时期虫体1h后,4龄幼虫和蛹期体内PvERR,PvMet,PvKr-h1和PvSRC基因的表达量均无显著性变化。处理6h后,4龄幼虫和蛹期体内PvERR的相对表达量显著降低,并且随着处理时间的延长,相对表达水平进一步出现显著下降趋势。与蛹期虫体相比,4龄幼虫期处理组PvERR相对表达水平降低更明显。处理6 h后,4龄幼虫和蛹期的PvMet表达量显著升高,与处理时间呈现正相关。处理6 h,12 h,24 h后,4龄幼虫和蛹期PvKr-h1相对表达量均显著升高,但这三个时间段处理组之间无显著差异。处理6 h后,4龄幼虫和蛹期的PvSRC相对表达量显著升高,并且与处理时间呈现正相关。由此表明,JH信号通路中的PvMet,PvKr-h1和PvSRC基因在外源JHⅢ诱导下,表达量显著升高,初步证实在拟黑多刺蚁中,这三者确实参与到JH信号通路。PvERR也能够应答外源JHⅢ,但PvERR的表达结果与PvMet,PvKr-h1和PvSRC基因的表达结果相反,表明PvERR与JH作用的发挥呈现负相关。3.本研究通过RNA干扰技术进一步从基因转录水平证实了PvERR与JH信号通路存在着相关性。选择JH信号通路关键基因表达量较高的2龄幼虫和雌性成虫为实验材料,根据PvERR基因序列设计对应的double-stranded RNA（dsRNA）,以dsPvERR表示,采用饲喂的方法对拟黑多刺蚁这两个发育时期的虫体进行不同剂量、不同时间的连续的RNAi处理。选择最佳处理剂量与时间,检测PvERR-RNAi后JH信号通路关键基因PvMet,PvKr-h1,PvSRC在mRNA和蛋白质水平相对表达量的变化,进一步分析了PvERR与JH信号通路的相关性。研究结果显示:与Control组和GFP-RNAi组相比,PvERR-RNAi后,2龄幼虫和雌性成虫体内PvMet,PvKr-h1,PvSRC的mRNA表达水平显著升高,说明下调PvERR的mRNA表达会提升JH信号通路关键基因PvMet,PvKr-h1,PvSRC的mRNA表达。4.本研究发现,在拟黑多刺蚁中,PvMet、PvKr-h1、PvSRC均参与JH信号通路,并且PvKr-h1及PvSRC的表达会受到PvMet的调控,可能呈现上下级联关系;PvERR,PvMet可以通过昆虫体内20E信号通路与JH信号通路来相互影响的。本研究以2龄幼虫和雌性成虫为实验材料,设计dsPvMet,采用饲喂的方法对拟黑多刺蚁这两个不同发育时期的虫体进行不同剂量、不同时间的连续的RNAi处理。选择最佳处理剂量与时间,检测分析了 PvMet-RNAi后,PvERR、PvKr-h1,PvSRC在mRNA和蛋白质水平相对表达量的变化。结果显示:对2龄幼虫和雌性成虫进行PvMet-RNAi后,与Control组和GFP-RNAi组相比,虫体内PvKr-h1,PvSRC的表达均有显著的降低。而PvMet-RNAi后,PvERR的表达增强,这与PvERR-RNAi后,PvMet的表达增强趋势是一致的。5.本研究发现,在拟黑多刺蚁的JH信号通路中,PvMet-RNAi一定时间后,能够影响PvKr-h1、PvSRC及PvERR对外源JHⅢ的应答;PvKr-h1-RNAi一定时间后,能够影响PvSRC对外源JHⅢ的应答。PvMet与PvKr-h1之间可能存在着PvMet对PvKr-h1的单向调节。PvMet、PvKr-h1这两个基因与Pv5SRC对外源JHⅢ的应答有直接关系,三者存在着关联性。PvERR对外源JHⅢ的应答依赖于PvMet的表达,但不需要PvKr-h1的参与。本章节研究以拟黑多刺蚁4龄幼虫为实验材料,设计dsPvKr-h1,采用饲喂的方法分别对虫体进行不同剂量的PvMet-RNAi或PvKr-h1-RNAi连续处理6 d,分别检测干扰后PvMet和PvKr-h1的mRNA表达水平,确定最佳剂量。将4龄幼虫分成八组,其中四组为PvMet-RNAi组,四组为PvKr-h1-RNAi组,分别进行丙酮处理,外源JHⅢ处理,饲喂dsPvMet或dsPvKr-h1进行RNAi处理,饲喂dsPvMet或dsPvKr-h1连续干扰6 d后再施加外源JHⅢ处理24 h。实验结束后,检测相关基因的mRNA表达量变化。PvMet-RNAi组:在添加外源JHⅢ后,PvKr-h1及PvSRC的mRNA表达水平显著上升,PvERR的mRNA表达水平受抑制。在进行PvMet-RNAi后,PvKr-h1及PvSRC的mRNA表达水平显著下调,PvERR的mRNA表达水平显著上升。当进行PvMet-RNAi连续6 d后,再施加外源JHⅢ处理24 h,发现PvKr-h1和PvSRC的mRNA表达量无法再上调,PvERR的表达量不再被抑制。初步表明这三个基因应答外源JHⅢ需要PvMet参与。PvKr-h1-RNAi组:在添加外源JHⅢ后,PvMet及PvSRC的mRNA表达水平显著上升,PvERR的mRNA表达水平显著降低。在进行PvKr-h1-RNAi后,PvMet及PvERR的表达没有明显变化,PvSRC的表达水平显著下调。当进行PvKr-h1-RNAi连续6 d后,再施加外源JHⅢ处理24 h,发现PvMet的表达仍能显著上调,PvERR表达量仍会显著降低,但PvSRC表达量无法再上调。综上所述,本研究在拟黑多刺蚁体内成功克隆和鉴定了Met,Kr-h1和SRC的部分cDNA序列,分析了 PvERR,PvMet,PvKr-h1及PvSRC这四个基因在拟黑多刺蚁2龄幼虫、4龄幼虫、蛹期、雌性成虫及雄性成虫这五个重要发育时期中的mRNA水平相对表达模式,初步表明了PvERR与JH信号通路存在着相关性。通过RNAi技术和外源JHⅢ诱导技术,探讨了 PvERR,PvMet,PvKr-h1,PvSRC之间的关系以及这四个基因在JH信号通路级联反应中的作用,进一步明确了 PvERR参与拟黑多刺蚁JH信号通路的调控作用。这为深入了解社会性昆虫的生长、发育及繁殖过程提供了具有重要参考价值的实验数据。