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百日咳是由百日咳杆菌(Bordertella pertussis)引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病。传统的全细胞和无细胞百日咳疫苗的应用在很大程度上控制了百日咳的流行,但是由于这些疫苗本身存在的一些问题如副反应大,保护率相对低下等使得其临床应用受到限制,导致接种覆盖率下降。据统计,近年来百日咳患病率呈现出明显的上升趋势,出现了所谓的“复燃”现象;因此,有必要开发一种新型的安全有效的疫苗来取代市场上的传统疫苗。近年来的研究表明,基因工程疫苗有望成为继全细胞和无细胞百日咳疫苗以来的第三代百日咳疫苗,而亚单位疫苗是目前基因工程疫苗最常见的形式。与传统疫苗相比,基因工程亚单位疫苗具有明显的优势。表现在:设计灵活,针对性强,可选择优势抗原进行合理的组合设计,安全性高,成本低廉,能够诱导高效、特异的免疫应答等。近年来,亚单位疫苗在感染性疾病的疫苗研究中取得了明显的进展,正逐步成为疫苗研究的主要方向。安全有效的候选抗原的筛选是研制亚单位疫苗的重要前提,理想的重组亚单位疫苗应该是能引起显著保护性免疫应答的最小、无毒的蛋白片段。目前,关于百日咳杆菌亚单位疫苗的研究还比较少,而且用于研究的抗原成分主要是百日咳毒素(pertussis toxin, PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin, FHA)和百日咳杆菌粘着素(Pertactin, Prn)。由于这些抗原成分分子量都很大,直接重组表达基本不可能,现在的研究主要是从中筛选具有免疫原性的片段并对其保护性进行研究。近年来研究表明,百日咳毒素S1亚单位突变体9K/129G(S1’)和位于FHA羧基端的一个包含456个氨基酸的片断(FHA’)具有良好的免疫原性,免疫动物后能产生特异性保护性抗体,并在百日咳杆菌攻毒实验中取得了良好的实验效果。然而,在前期实验中,我们成功的把这两个片段及其融合基因克隆到了真核表达载体pET22b, 28a, 30a, pTRC99A and pQE30中,除了S1’在pQE30中有低量表达外,其他均不能表达,因此,如何提高这些蛋白的表达量是我们需要首先解决的问题。基于上述认识,本课题主要进行了以下实验研究。一、抗原的进一步筛选鉴于S1’本身已经比较小,本研究考虑从FHA’中筛选具有良好免疫原性的片段进行克隆表达。采用软件DNAstar对FHA’的抗原性、亲水性、柔韧性和表面可及性进行综合分析,筛选出了一个具有良好免疫原性的片段Fs。采用该片段构建的重组质粒pET22b- Fs在大肠杆菌BL21中获得了高效表达(50%以上)。Western Blot结果显示,该蛋白能与一株抗FHA全长的单抗反应,说明该蛋白具有良好的免疫反应性,含有FHA片段中的优势表位,是良好的百日咳疫苗候选抗原。二、疫苗候选蛋白的克隆表达与纯化在成功筛选Fs的基础上,我们试图通过将该片段与S1’融合表达,间接提高后者的表达量。采用重叠延伸PCR的方法将Fs和S1’以适当的linker相连,获得了融合基因FsS1’,该基因克隆至原核表达载体pET22b后,得到的重组工程菌pET22b- FsS1’/BL21获得了高效表达(30%),成功解决了S1’难以表达的技术瓶颈。在此基础上成功构建了重组工程菌pET22b- FsS1’S1’/BL21,经IPTG诱导,重组蛋白的表达量约为15%。采用不同的纯化方案对以上三个蛋白分别进行了纯化,纯化后的蛋白纯度均达到90%以上,满足了后续实验的需求。三、疫苗候选蛋白的生物学活性研究实验证实,重组蛋白Fs、FsS1’和Fs S1’S1’基本丧失了天然S1所具有的不良的生物学活性,它们都不能明显的诱导小鼠白细胞升高和CHO细胞聚集,其与对照组(S1、PT)之间存在显著差异(p<0.01)。将FsS1’和rFs S1’S1’分别免疫家兔,ELISA证实:获得的多抗血清能够与天然的PT和FHA相结合。FsS1’和Fs S1’S1’多抗血清抗PT效价分别为1:128 000和1:256 000;抗FHA抗体效价均为1:256 000。双向免疫扩散实验得到了类似的结果。证实这两个融合蛋白具有良好的免疫原性。四、动物保护实验通过预试验获得疫苗蛋白的最佳免疫剂量和百日咳杆菌的最佳攻毒浓度。以Al(OH)3为佐剂,将重组蛋白Fs、FsS1’和Fs S1’S1’采用腹腔注射的方式免疫小鼠,收集免疫血清检测其特异性抗PT和FHA抗体水平,证实其与对照组相比存在一定差异,通过脑腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护效应。综上所述,本研究成功的从FHA中预测出了一个具有良好免疫原性的片段Fs,将其与S1’融合表达后获得了后者的高效表达,并对Fs和融合蛋白FsS1’和rFs S1’S1’分别进行了纯化。通过实验证实,融合蛋白失去了天然PT所具有的不良的生物学活性而保留了良好的免疫原性,并通过动物实验验证了其保护效果,认为FsS1’和Fs S1’S1’可作为较为理想的疫苗候选蛋白,本课题的实施为新型百日咳疫苗的研究奠定了良好的基础。