类胡萝卜素是类异戊二烯类色素,在植物中作为光合辅助色素和抗氧化剂起着重要作用。在烟草中,类胡萝卜素是烟叶重要致香物质的前体物。类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)能够催化类胡萝卜素降解,生成小分子天然活性物质,这些物质能够参与合成天然香料物质、挥发性香味物质、以及响应非生物胁迫的植物激素ABA/SLs。9-顺式环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(NCED3b)是CCD基因家族成员之一,是激素ABA合成途径中的关键酶基因。ABA在胚胎发生、种子萌发、叶片气孔关闭、果实成熟、叶片衰老等植物生长发育过程起到重要作用,此外还能够响应干旱、低温、盐渍、水涝等非生物胁迫。所以,NCED3b基因对植物的生长以及响应胁迫起到重要的作用。然而,烟草中CCD基因家族和NCED3b基因对烟草耐旱性影响研究较少。为了系统分析CCD基因家族的基本特征和NCED3b基因的功能,本研究首先从栽培烟草红花大金元、绒毛状烟草和林烟草中分别鉴定出了 19、11和10条CCD基因。然后系统分析了 CCD基因家族的系统发育关系、基因结构、保守motif、基因重复、顺式作用元件、亚细胞和染色体定位、miRNA靶位点、分子进化特征,同时分析了 CCD基因在烟草不同组织及各种不同处理下的基因表达模式,为该家族基因的功能分析奠定了基础。在此基础上,分析了实验室前期获得的烟草NtNCED3b RNA干扰表达对烟草生长发育、物质代谢、相关基因表达、光合能力的影响,同时检测了烟草的抗旱能力。本研究初步了解了烟草CCD基因家族的特征,并对NCED3b基因的功能进行了解析。主要研究结果如下:1.根据系统发育分析结果,将烟草CCD基因家族分为两个亚家族,CCDs和NCEDs亚家族,进一步分为 9 个小组(CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、CCDL、NCED2、NCED3、NCED5、NCED6)。基因结构分析表明,同一组内基因外显子/内含子的数目相似,NCED亚家族成员几乎没有内含子,CCD亚家族成员内含子数量较多,为1-14个内含子。motif预测发现,同一组内蛋白中motif的种类和位置比较相似,所有CCD家族蛋白都含有motif 3、4、5、6和11,motif 2、3、5和8含有四个保守的与铁离子连接的组氨酸(H)残基,motif 2、4和11含有蛋白活性所需的保守谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)残基。蛋白质的三维结构预测结果表明,CCD蛋白主要由无规则卷曲和β-折叠组成,多数蛋白均包含酶活性发挥所必需的4个保守的组氨酸和3个谷氨酸或天冬氨酸残基。染色体定位结果显示,红花大金元的19个基因有3个基因在scaffolds上,另外16个基因分布在13条染色体上。共线性分析结果显示CCD基因家族的扩张主要由全基因组重复和片段重复事件引起。亚细胞定位预测表明,CCD家族的蛋白主要位于细胞质和质体中,试验也证实了该预测结果。进化分析结果表明,CCD基因家族在进化过程中纯化选择占据主导地位,但在烟草CCD亚家族的祖先分支上鉴定出7个正选择位点。miRNA靶位点预测发现,在CCD家族的五个小组中鉴定出七个miRNAs靶位点。启动子分析表明,CCD启动子的顺式调控元件主要参与光反应、激素应答和生理应激反应。实时荧光定量PCR分析发现,CCD家族基因主要在根、花、种子和叶中表达,不同基因存在组织特异性;并在不同激素处理(ABA、MeJA、IAA、SA)和非生物(干旱、寒冷、高温)胁迫下表现出不同的表达模式。2.我们获得了烟草NtNCED3b RNAi抑制表达株系。NtNCED3b RNAi抑制了烟株初生根的发育,导致烟株发育迟缓,生物量降低,叶片腺毛数量减少。与野生型植株相比,NtNCED3b RNAi降低了植株叶片表面分泌物(主要是CBT-diols,α-CBT-dio1和β-CBT-diol)的含量、光合色素(包括总叶绿素,叶绿素a,叶绿素b,总类胡萝卜素,β-胡萝卜素,叶黄素和新黄素)的含量及异戊二烯代谢途径中关键基因的表达。同时烟草NtNCED3b RNAi导致烟株净光合速率(Pn),叶片气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)显著下降,植株的光合能力降低,进而可能影响与其相关的其他生理和生化过程。干旱处理后,转基因植株的MDA含量明显增加,且显著高于WT;抗氧化酶含量显著升高,但低于WT;干旱处理显著影响NtNCED3b RNAi株系激素(ABA、GA3、ZR、IAA)的代谢,说明NtNCED3b RNAi抑制表达降低了烟草抗旱能力。同时,研究结果也表明NtNCED3b通过ABA反馈调节异戊二烯代谢途径的上游物质含量,参与调控植物生长发育和干旱胁迫响应。