毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)是一种在世界范围内广泛使用的有机磷杀虫剂,可以有效杀灭多种咀嚼式及刺吸式口器害虫。但其可以经由地表径流等途径进入水体,提高水生生物的损害风险。中性粒细胞在机体固有免疫过程中起主要作用,同时,也是血液非特异性细胞免疫的关键组分。最新研究表明,中性粒细胞除了通过释放免疫因子等方式行使免疫功能,还可通过释放中性粒细胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)阻止不利因素对机体的伤害。为了探究CPF对鲤鱼中性粒细胞释放NETs的影响,本试验在建立CPF暴露的中性粒细胞模型基础上,以4μM PMA刺激中性粒细胞,建立NETs释放模型,同时利用扫描电镜,荧光染色,实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹等手段,从氧化应激、热休克蛋白、炎症引起的程序性坏死角度出发,使用程序性坏死抑制剂(Nec-1),并探讨了CPF对NETs释放过程中的PKC/MAPK通路及呼吸爆发的影响,旨在阐明CPF暴露对鲤鱼中性粒细胞免疫障碍的影响。试验结果如下:(1)CPF急性暴露时,ROS的释放量以剂量依赖性方式升高,损伤鲤鱼中性粒细胞抗氧化系统,促使热休克蛋白和炎性因子的表达水平升高,进一步促进程序性坏死因子MLKL、RIP3等表达量升高,caspase8的表达量降低。程序性坏死抑制剂Nec-1可以显著上调caspase8的表达水平,而RIP1,RIP3和MLKL等关键基因的表达被下调。表明CPF急性暴露可导致中性粒细胞程序性坏死的发生。(2)CPF暴露会造成鲤鱼中性粒细胞的形态学损伤,细胞褶皱增多,纤突缺失。CPF和PMA共处理组显示,CPF抑制了PMA诱导的中性粒细胞NETs的释放,还使NETs的网丝变短;加入程序性坏死抑制剂Nec-1后,NETs释放量明显增多,但仍无法恢复到作为阳性对照组的单独PMA刺激下的NETs释放量。此外,在CPF和PMA共同处理下,MPO的表达量及释放量均被明显降低。这些结果可以说明,CPF可明显抑制PMA诱导的鲤鱼中性粒细胞对NETs释放。(3)PMA刺激后,中性粒细胞PKC/MAPK通路被激活,ROS的释放量明显增多,中性粒细胞发生呼吸爆发。CPF预处理可抑制PMA引起的PKC/MAPK通路的激活,从而抑制呼吸爆发水平。但和Nec-1共处理后,CPF暴露下PMA引起的呼吸爆发水平被部分恢复。此外,CPF单独处理时,中性粒细胞内ROS释放量以时间依赖性上升。以上结果表明,CPF可以负调控PKC/MAPK通路,促使鲤鱼中性粒细胞ROS释放量增多,发生氧化应激,但会抑制PMA引起的呼吸爆发,从而抑制NETs的生成。综上所述,CPF急性暴露可以引起鲤鱼中性粒细胞发生氧化应激,造成炎症损伤和热休克蛋白积累,从而促进程序性坏死,抑制NETs的释放;此外,CPF还可以通过负调控PKC/MAPK通路,降低中性粒细胞细胞呼吸爆发水平,抑制NETs的生成。本研究为进一步研究CPF暴露的毒理学机制提供了借鉴,为环境保护及生物固有免疫调节提供新的理论依据。