【摘 要】
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背景:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起中耳炎和致死性细菌性脑膜炎。肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，但近年来肺炎链球菌临床菌株对β-
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背景:肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是人类细菌性肺炎主要病原体，也可引起中耳炎和致死性细菌性脑膜炎。肺炎链球菌不产生β-内酰胺酶，但近年来肺炎链球菌临床菌株对β-内酰胺类抗生素耐药率不断升高，青霉素结合蛋白(penicilin binding proteins，PBPs)突变被认为是主要的耐药机制。近年文献报道，肺炎链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶StkP与PBPs非依赖性耐药密切相关且与磷酸酶PhpP形成信号偶联(signaling couple)。信号传导本质是信号分子磷酸化或去磷酸化的过程。因此，证实肺炎链球菌PhpP磷酸酶活性并了解其酶动力学特性可为深入研究肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药机制奠定基础。 目的:构建肺炎链球菌磷酸酶编码基因phpP原核表达系统，确定重组表达产物rPhpP磷酸酶活性与类型，了解亚致死量青霉素（青霉素类抗生素代表）和头孢噻肟（头孢菌素类抗生素代表）诱导肺炎链球菌phpP基因mRNA（phpP-mRNA）表达上调的作用。 方法:采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因，T-A克隆后测序。采用NCBI数据库中Conserved Domain Database(CDD)软件对上述肺炎链球菌PhpP序列中磷酸酶功能结构域进行预测及分析。以pET42a为表达载体、E.coliBL21 DE3为表达宿主菌，构建phpP基因原核表达系统。采用SDS-PAGE及凝胶图象分析系统检查目的重组表达产物rPhpP的表达情况及其可溶性。采用丝/苏氨酸磷酸酶试剂盒检测rPhpP水解PP2C型磷酸酶底物活性并测定其酶动力学参数Km和Kcat值。采用E-test测定青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。采用实时荧光定量RT-PCR检测亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MIC）作用前后肺炎链球菌ATCC6306株php P-mRNA水平变化。 结果:所克隆的肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因核苷酸和氨基酸序列与GenBank中公布的肺炎链球菌P6株phpP基因序列完全相同。CDD分析结果显示，肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因序列中含有PP2Cc型磷酸酶的结构功能域。所构建的工程菌株E.coli BL21DE3pET42a-phpP能有效表达可溶性的rPhpP。rPhpP能水解PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶底物磷酸肽(RRA(pT)VA)且其活性随rPhpP浓度增加而升高，其酶学动力学参数Km和Kcat值分别为277.35μmol/L和0.71S-1。青霉素和头孢噻肟对肺炎链球菌ATCC6306株的MIC分别为0.023和0.032μg/ml。亚致死量青霉素和头孢噻肟（1/4和1/8 MICs）作用后，肺炎链球菌ATCC6306株phpP-mRNA水平显著升高(p＜0.05)。 结论:本研究成功地构建了肺炎链球菌phpP基因原核表达系统并表达了可溶性有活性的产物rPhpP。肺炎链球菌phpP基因表达产物为高活性的PP2C型丝/苏氨酸磷酸酶。亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导phpP基因表达上调，提示在StkP/PhpP信号偶联中PhpP可去磷酸化影响StkP功能，从而在肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药中发挥作用。本课题研究结果为后继深入研究StkP/PhpP信号偶联介导肺炎链球菌PBPs非依赖性耐药的分子机制奠定了基础。
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