骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性骨肿瘤，好发于青少年，约占儿童恶性肿瘤 5%。骨肉瘤恶性程度高，易复发和发生肺转移。高发的肺转移率和患者的较差预后相关。尽管近年来新辅助化疗、手术和术后化疗联合治疗明显改善患者的预后，但由于化疗药物耐药产生，常常导致肿瘤复发和发生肺转移，这也是引起骨肉瘤患者死亡的主要原因。因此，临床亟待找出更有效的针对骨肉瘤耐药、复发和转移的治疗措施。　　骨肉瘤的转移也类似于其它实体性肿瘤，是一个多环节多步骤的过程。是肿瘤细胞脱离原发灶转移至远处组织继续生长的复杂的生物学过程，主要包括肿瘤细胞骨架重排、细胞变形、降解细胞外基质、穿透基底膜、细胞迁移、失巢凋亡抵抗、经血管或淋巴管到达远处组织、新生血管的植入及肿瘤细胞恶性增殖形成新的转移灶。当肿瘤细胞脱离原发灶进入循环系统，失去了细胞间或者细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）联系后将发生死亡，这种特殊的死亡方式称为失巢凋亡（Anoikis）。因此获得抗失巢凋亡能力是肿瘤的进展和远处转移的关键步骤。肿瘤形成远处转移灶的另外一个重要过程是血管新生，新生血管的形成不仅为转移灶的生长提供氧气和营养，也是肿瘤转移的主要通道。因此，通过探究骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞对血管生的影响及调控的分子机制可能为转移性骨肉瘤治疗提供新的策略。　　本研究中，我们首先通过细胞悬浮培养、流式细胞术、免疫荧光、PCR、Western-blot、ELISA、细胞划痕实验、细胞增殖实验、小管形成实验等方法研究失巢凋亡抵抗细胞对血管生成的影响及可能的分子机制。然后通过免疫组织化学染色检测 P-Src、VEGF-A及CD31在人骨肉瘤组织标本中表达情况，并且分析了与患者临床病理参数及微血管密度之间的相关性。此外我们利用TCGA数据库分析了Src和VEGF-A的基因表达与骨肉瘤患者临床预后关系。最后通过裸鼠皮下移植瘤模型建立，体内研究失巢凋亡抵抗细胞对血管生成的影响及可能分子机制。主要实验内容、结果及结论如下：　　1.人骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞体外对血管生成的影响及可能机制　　利用超低黏附板构建骨肉瘤MTH、U2OS 细胞失巢凋亡抵抗模型（MTHar、U2OSar），采用流式细胞仪检测细胞凋亡率进行模型鉴定。与亲本细胞相比，失巢凋亡抵抗细胞在悬浮培养状态下凋亡率明显下降。收集肿瘤细胞上清，与HUVEC细胞共培养，发现失巢凋亡抵抗细胞显著促进内皮细细胞的增殖、迁移和小管形成。Real-time PCR、ELISA和Western blot检测MTHar和U2OSar细胞中VEGF-A的mRNA和蛋白表达明显升高，且伴随P-Src、P-Jnk、及P-Erk通路的激活，P-P38蛋白未见明显变化。在失巢凋亡抵抗细胞中利用Src抑制剂PP2作用24 h后，细胞中VEGF-A的mRNA和蛋白表达显著降低，促血管生成能力明显减弱，P-Src、P-Jnk及P-Erk的表达下调。上述结果表明，骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞可能通过激活 Src/MAPK(Jnk/Erk)通路促进 VEGFA 表达进而促进血管生成。　　2. P-Src、VEGF-A及MVD在骨肉瘤组织标本中的表达及意义　　本实验收集 26 例骨肉瘤组织标本进行免疫组织化学染色。发现 P-Src 和 VEGF-A主要表达于骨肉瘤细胞胞质中，阳性率分比为 50%（13/16）和 61.5%（16/26）。P-Src和VEGF-A的高表达和患者的肺转移显著相关（P＜0.05）。P-Src的表达和Enneking分期相关（P＜0.05），二者表达与患者的年龄、性别、肿瘤体积、病理类型和复发无明显相关性（P＞0.05）。TCGA数据库中Kaplan-Meier分析显示Src和VEGF-A的表达与患者总生存期显著相关（P＜0.05）。为了进一步研究P-Src对骨肉瘤血管生成的作用，通过与VEGF-A和MVD 的相关性分析。结果发现P-Src的表达与VEGF-A的表达显著正相关（r = 0.474，P= 0.014），与肿瘤微血管密度（MVD）也显著正相关（r = 0.545，P= 0.004）。P-Src 的表达在骨肉瘤的转移和血管生成中发挥重要作用，可作为骨肉瘤患者预后的生物学指标。　　3.人骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞体内对血管生成的影响及可能的分子机制　　通过裸鼠皮下移植瘤模型建立，将移植瘤组织免疫组织化学检测后发现，与对照组相比，骨肉瘤失巢凋亡抵抗组P-Src和VEGF-A的表达明显升高（P＜0.05），且肿瘤微血管数量明显增多（P<0.05）。体内实验表明，失巢凋亡抵抗细胞可能通过激活Src通路，以及上调VEGF-A的表达促进肿瘤血管的生成。　　综上所述，骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞可能通过激活Src介导的MAPK(Jnk/Erk)通路上调VEGF-A表达，进而促进内皮细胞的增殖、迁移和小管形成来影响肿瘤血管生成。该研究通过体内及体外实验阐述了人骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞促血管生成的潜在机制。Src 激酶在骨肉瘤转移和血管生成中发挥着重要作用，可作为骨肉瘤抗血管生成潜在的治疗靶点。