【摘 要】
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目的:应用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的核酸,为临床快速诊断EV71感染提供依据。EV71拥有复杂的免疫逃逸机制阻碍宿主细胞固有免疫应答,固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,病原微生物入侵宿主细胞时,宿主通过自身模式识别受体(Pattern reco
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目的:应用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的核酸,为临床快速诊断EV71感染提供依据。EV71拥有复杂的免疫逃逸机制阻碍宿主细胞固有免疫应答,固有免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,病原微生物入侵宿主细胞时,宿主通过自身模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体的病原相关模式分子(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),刺激下游适配体蛋白级联反应,从而激活宿主细胞相应的信号通路,诱导Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ Interferon,IFN-Ⅰ)及多种促炎细胞因子的产生,以抵抗病原微生物的感染。研究表明,去泛素化酶在抗病毒固有免疫中发挥了重要作用,本文旨在探讨去泛素化酶USP24在EV71感染引起的固有免疫反应中的调控机制,以便为临床治疗手足口病提供新的思路。方法:收集14例咽拭子标本,采用LAMP法检测EV71及其它常见的19种呼吸道病毒。EV71感染人横纹肌肉瘤(RD)细胞8h后,提取细胞RNA,采用PCR基因芯片法分析88种去泛素化酶的表达。USP24敲减(shUSP24)质粒转染RD细胞48h后,收集细胞提取总RNA,RT-qPCR检测EV71病毒复制水平和USP24 mRNA的表达情况,进一步检测细胞IFN-β的分泌;Western blot检测转录因子IRF3的磷酸化水平。免疫共沉淀法检测USP24和TANK1结合激酶1(TANK binding kinasel,TBK1)的结合;TBK1过表达质粒与Ub,Ub-K48或Ub-K63突变质粒分别共转染HEK293T细胞,分析USP24对TBK1泛素化和蛋白稳定性的影响。结果:LAMP法检测的14例咽拭子标本中,EV71合并人鼻病毒2例、人鼻病毒4例、人鼻病毒合并柯萨奇病毒A6型6例、人副流感病毒1型1例、人副流感病毒3型1例,其中EV71及柯萨奇病毒A6型经常州CDC q-PCR验证。EV71感染促进去泛素化酶USP24表达。免疫共沉淀试验显示内源性的USP24 可以与TBK1结合;USP24特异性移除TBK1分子中的K63泛素链以降低其稳定性,从而抑制下游Ⅰ型干扰素的表达及抗病毒免疫反应。EV71感染RD细胞后,细胞内的p-IRF3水平未见明显升高,而敲低USP24基因后,p-IRF3水平明显上调,IFN-β mRNA及蛋白水平也明显提高。免疫荧光抗体检测发现敲低USP24后IRF3核转位增多,并抑制了 EV71的复制和减少了细胞病变效应。结论:LAMP法可快速检测临床样本中EV71,为临床诊断EV71感染提供依据。EV71感染可上调去泛素化酶USP24,USP24能特异性移除TBK1分子上K63的泛素链,使TBK1蛋白稳定性降低,负向调控TBK1介导的IFN-Ⅰ固有免疫信号通路。
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