【摘 要】
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生物固氮无论是对农业生产还是环境保护都具有很高的价值,而生物固氮中固氮效率最高的是豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮。在植物与微生物互作中,微生物向植物细胞内部分泌的效应蛋白在调控宿主免疫反应中起关键作用。豆科植物与根瘤菌的共生互作是研究植物-微生物互作的一个典范。根瘤菌的识别、入侵、定殖以及根瘤固氮酶活等都受植物免疫反应的调控。大豆作为一种重要的经济作物,其生长周期中所需氮素的绝大部分来源于根瘤菌的
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生物固氮无论是对农业生产还是环境保护都具有很高的价值,而生物固氮中固氮效率最高的是豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮。在植物与微生物互作中,微生物向植物细胞内部分泌的效应蛋白在调控宿主免疫反应中起关键作用。豆科植物与根瘤菌的共生互作是研究植物-微生物互作的一个典范。根瘤菌的识别、入侵、定殖以及根瘤固氮酶活等都受植物免疫反应的调控。大豆作为一种重要的经济作物,其生长周期中所需氮素的绝大部分来源于根瘤菌的共生固氮。然而大豆与大豆根瘤菌共生互作的分子调控机制大都未知。前期实验室研究发现,大豆根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110三型分泌系统突变会导致结瘤效率显著下降,这表明USDA110三型效应蛋白参与调控了与大豆的共生互作。本课题综合免疫和共生两个方面来研究众多的效应蛋白,筛选到抑制免疫反应的根瘤菌效应蛋白,以解析该效应蛋白介导共生信号通路的分子机制。我们筛选到了大豆根瘤菌USDA110中的关键效应蛋白NopZ,并针对这一蛋白开展了一系列探究,主要结果如下:1.克隆了大豆根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110的72个效应蛋白基因到本氏烟草瞬时转化载体pGWB5XX-35S-1x FLAG上,通过烟草瞬时转化系统,分别与已知的能诱导本氏烟草细胞死亡的GmNFR1＆NFR5共注射,筛选到了16个能显著抑制或促进GmNFR1＆NFR5引起的细胞死亡的效应蛋白。2.将烟草注射中筛选到的效应蛋白基因克隆到酵母pGBKT7载体上,通过酵母双杂交系统,将共生信号通路中关键蛋白GmNFR1、GmNFR5、Lj Sym RK、GmNORK、GmCca MK的激酶域与之杂交,并进行一对一验证,筛选到了一个与GmNORK和Lj Sym RK有强烈互作,编号为E72,在NCBI上注释为NopZ的效应蛋白。3.为了确定效应蛋白NopZ与靶标蛋白GmNORK的互作,进一步通过双分子荧光互补体系来验证,并通过烟草瞬时转化体系,确定NopZ主要定位于细胞膜附近和细胞核。4.在体外原核表达系统中表达GST-NopZ和His-GmNORK-KD,通过Pull-down体外生化实验进一步验证了其与大豆共生激酶GmNORK在信号通路上的相关性。5.进行了两次独立重复的毛根转化实验并通过qRT-PCR验证了毛根转化体系的可靠性,初步得出了NopZ在共生结瘤上起到正调控作用的结论。以上这些结果揭示了NopZ的初期表型,证明NopZ这一效应蛋白与共生激酶GmNORK在信号通路上相互关联,进而促进大豆结瘤共生。
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