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背景及目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块中可检测到典型的细胞衰老变化,衰老细胞表达炎性因子和黏附分子等增加,产生促炎症环境而进一步诱导炎性细胞迁移。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是AS斑块纤维帽的主要细胞类型之一,其衰老可加速AS发展。活血胶囊(Huoxuejiaonang,HXJN)具有一定抗炎及稳定斑块作用,但对于细胞衰老的影响和机制尚不清楚。因此,本实验研究HXJN对H2O2诱导小鼠VSMC细胞衰老的抑制作用及其分子机制。
方法:以体外培养的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(Mouse aortic vascular smooth muscle cells,MOVAS)为研究对象,研究药物抗衰老作用时,先给与HXJN处理细胞24h,之后进行H2O2处理3-5h,换回正常培养液继续孵育24h后进行检测。(1)HXJN不同浓度处理细胞24h后,WST-1试剂盒检测细胞活力值;(2)采用衰老相关β-半乳糖酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测细胞状态;(3)采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测细胞内炎性因子及相关分子的基因表达水平变化;(4)采用免疫蛋白印迹(Western Blot)技术检测相关蛋白分子的表达水平;(5)采用流式细胞仪检测VSMC的细胞周期变化。
结果:(1)HXJN在各浓度(0μg/mL、150μg/mL、300μg/mL、750μg/mL)均不引起细胞活力降低,浓度为750μg/mL时可引起细胞活力升高。(2)与对照组相比,H2O2组的衰老细胞明显增多,表现为显著体积增大,多个核,SA-β-gal染色深,而HXJN+H2O2组的衰老细胞明显较H2O2组少。(3)H2O2诱导可使VSMC中细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、IL-8(interleukin-8)和IL-6(interleukin-6)的mRNA表达水平显著升高,而HXJN可抑制H2O2诱导的ICAM-1和IL-6mRNA表达升高,且对IL-6mRNA表达的抑制作用具有剂量依赖关系,但HXJN对IL-8升高无抑制作用。(4)HXJN可显著抑制H2O2诱导的S期细胞比例的下降。(5)HXJN单独作用可使细胞中沉默信息调节蛋白-1(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT-1)mRNA表达水平轻度升高,H2O2处理可使细胞中SIRT-1mRNA表达水平显著降低,HXJN可抑制H2O2引起的SIRT-1mRNA表达水平降低。
结论:HXJN通过提高衰老VSMC细胞中SIRT-1mRNA和蛋白表达水平,抑制H2O2诱导的小鼠VSMC细胞衰老,表明SIRT-1可能是HXJN发挥抗VSMC衰老作用的靶点之一,这对于抑制AS斑块形成具有重要意义。
方法:以体外培养的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(Mouse aortic vascular smooth muscle cells,MOVAS)为研究对象,研究药物抗衰老作用时,先给与HXJN处理细胞24h,之后进行H2O2处理3-5h,换回正常培养液继续孵育24h后进行检测。(1)HXJN不同浓度处理细胞24h后,WST-1试剂盒检测细胞活力值;(2)采用衰老相关β-半乳糖酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色检测细胞状态;(3)采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测细胞内炎性因子及相关分子的基因表达水平变化;(4)采用免疫蛋白印迹(Western Blot)技术检测相关蛋白分子的表达水平;(5)采用流式细胞仪检测VSMC的细胞周期变化。
结果:(1)HXJN在各浓度(0μg/mL、150μg/mL、300μg/mL、750μg/mL)均不引起细胞活力降低,浓度为750μg/mL时可引起细胞活力升高。(2)与对照组相比,H2O2组的衰老细胞明显增多,表现为显著体积增大,多个核,SA-β-gal染色深,而HXJN+H2O2组的衰老细胞明显较H2O2组少。(3)H2O2诱导可使VSMC中细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、IL-8(interleukin-8)和IL-6(interleukin-6)的mRNA表达水平显著升高,而HXJN可抑制H2O2诱导的ICAM-1和IL-6mRNA表达升高,且对IL-6mRNA表达的抑制作用具有剂量依赖关系,但HXJN对IL-8升高无抑制作用。(4)HXJN可显著抑制H2O2诱导的S期细胞比例的下降。(5)HXJN单独作用可使细胞中沉默信息调节蛋白-1(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT-1)mRNA表达水平轻度升高,H2O2处理可使细胞中SIRT-1mRNA表达水平显著降低,HXJN可抑制H2O2引起的SIRT-1mRNA表达水平降低。
结论:HXJN通过提高衰老VSMC细胞中SIRT-1mRNA和蛋白表达水平,抑制H2O2诱导的小鼠VSMC细胞衰老,表明SIRT-1可能是HXJN发挥抗VSMC衰老作用的靶点之一,这对于抑制AS斑块形成具有重要意义。