背景局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是一种临床病理综合,临床表现为大量蛋白尿或肾病综合征,病理表现为受累部分肾小球毛细血管袢的非炎症性硬化,是儿童激素耐药型肾病综合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)及终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的常见原因。研究认为FSGS的发病机制与足细胞相关蛋白的基因突变有关,已发现超过30种的单基因突变可导致FSGS,因其在全球各地区的检出率不尽相同,推测中国患者致病基因的变异频率可能有其独特的分布形式。目的收集我院儿科近5年诊断为FSGS的临床病例,应用全外显子测序(whole exon gene sequencing,WES)技术进行基因检测,对新发现的变异位点进行生物信息学分析,并建立体外瞬时表达体系,以期探讨新变异位点的致病性及蛋白表达变化。方法1.应用病案检索系统搜索新乡医学院附属濮阳油田总医院儿科2014年1月至2019年1月收治的FSGS患儿,分析临床信息,取得患儿及家长同意,经过医院伦理委员会批准,分别取患儿及父母外周血样2mL,采用WES方法进行基因测序,检出变异位点后对先证者父母的DNA进行一代测序的验证,并以50例尿检正常儿童作为对照。2.对新发现的CRB2基因变异位点利用Clustal Omega在线网页进行多个物种氨基酸序列保守性分析;利用同源建模软件和三维结构分析软件对新发现CRB2基因变异的蛋白三维结构进行预测,分析变异位点对蛋白结构的影响。3.建立CRB2基因体外真核表达体系,以pcDNA3.1-EGFP为空载体,构建pcDNA3.1-CRB2-EGFP野生型载体和相应的变异型载体,提取上述质粒瞬时转染至HEK-293T细胞中,随后提取总蛋白,利用免疫荧光方法观察荧光表达情况,以及蛋白印迹分析(Western blot)方法检测CRB2基因蛋白表达水平。结果1.本研究共纳入9例,失访1例,在8例FSGS患儿中检测出1例存在CRB2基因变异,包括3个变异位点c.445G>T(p.E149X),c.2705C>T(p.T902M)和c.3190C>T(p.P1064S)。2.CRB2基因新变异位点(p.E149X、p.T902M、p.P1064M)的氨基酸在不同物种中高度保守;Swiss-Model同源建模软件和Swiss-Pdb Viewer三维结构分析软件,认为错义变异p.T902M和p.P1064S的三维结构与野生型相比无明显改变,属于轻型变异,而截短变异p.E149X不能形成完整的蛋白结构,属于重型变异。3.成功构建了CRB2基因体外真核表达体系,并在瞬时转染的HEK-293T细胞中获得了高效表达,实验结果显示,与野生型和错义变异型质粒T902M和P1064S相比,截短变异型质粒E149X转染的细胞不能检测到绿色荧光且Western blot检测的蛋白表达量减少。结论1.本研究首次在中国汉族散发性FSGS患儿中检测出CRB2基因位点的变异,且p.E149X、p.T902M、p.P1064M均为新发现的变异位点,丰富了CRB2基因变异谱。2.本研究对CRB2基因的野生型和变异型进行生物信息学分析和体外功能表达实验,提示p.T902M不是本例患儿的主要致病变异位点,p.P1064S基于蛋白结构预测可能有害,p.E149X可能是主要的致病变异位点。