背景:高血压是心血管疾病重要的危险因素,心脏损害是重要的血压相关的靶器官损害之一。心肌纤维化是高血压心脏重构的主要病理生理变化,由于心肌细胞外基质过度沉积及心脏成纤维细胞过度增殖从而导致胶原蛋白比例失调和胶原排列紊乱而引起心脏结构的变化和功能损害。磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）是一种调节因子,可负向调节磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）,被称之为PTEN/PI3K/AKT信号通路,主要参与细胞生长、细胞极化、细胞迁移、细胞结构改变以及细胞周期等多个细胞过程,还参与各种癌症、神经变性疾病、代谢障碍及伤口愈合。现有文献表明,激活PTEN/PI3K/AKT信号通路与降低心肌细胞的凋亡及改变巨噬细胞表型的表达水平有关,而后者与改善心肌纤维化有关。但是,目前尚未有研究直接证明PTEN/PI3K/AKT信号通路通过改变巨噬细胞表型以改善高血压所致心肌纤维化巨噬细胞对组织的炎性损伤和纤维修复发挥重要的作用。心肌中的巨噬细胞分两大类功能细胞:促炎症的巨噬细胞（M1型巨噬细胞）和抗炎症的巨噬细胞（M2型巨噬细胞）。M1型巨噬细胞可以分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素（IL）-1β和IL-6等促炎症因子,从而促进心肌纤维化。M2型巨噬细胞主要分泌IL-10、IL-4和IL-13等抗炎症因子从而具有抗纤维化的作用。已有研究表明,PTEN信号通路可增加抗炎症性M2型巨噬细胞表型表达增加,达到改善心脏缺血再灌注损伤所致心肌纤维化的作用。然而,PTEN信号通路的变化能否通过巨噬细胞表型的改变来改善高血压所致心肌纤维化尚不清楚。本研究假设PTEN信号通路调节巨噬细胞表型的表达来改善高血压所致的心肌纤维化。目的:本研究旨在探索PTEN信号通路对自发性高血压大鼠（SHR）心肌纤维化的作用,并证明其机制可能巨噬细胞表型变化有关。其次,探索PTEN抑制剂VO-OHpic是否可以增加M2巨噬细胞表型的表达,从而改善高血压所致的心肌纤维化。方法:本实验采用体内和体外相结合的实验方法,实验内容如下:1、体内实验:20只30周龄的SHR大鼠（200±10 g）,随机分为SHR组（n=10）和VO-OHpic组（n=10）。10只Wistar-Kyoto（WKY）大鼠为对照组。SHR大鼠行VO-OHpic干预8周（10μg/kg/day,皮下注射）。测量SHR大鼠的心脏重量/胫骨长度比值（HW/TL）及左心室重量/胫骨长度比值（LVW/TL）。小动物超声心动图评估SHR大鼠心脏功能和结构;Masson染色、酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blot检测SHR大鼠心肌组织中纤维化标志物的表达水平[包括胶原（Col）-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）]及细胞因子（促炎症因子:TNF-α和IFN-γ;抗炎症因子:IL-10）的释放水平。免疫组化（IHC）和Western blot测定心肌组织中M1型和M2型巨噬细胞表型的表达（M1:CD80和CD86;M2:CD163和CD206）、心脏成纤维细胞（CFs）增殖水平及PTEN信号通路相关蛋白表达水平。2、体外实验:单核细胞系THP-1用氟波脂诱导成巨噬细胞后,再使用AngⅡ（0.1μM）干预巨噬细胞24 h。选用si RNA敲低巨噬细胞的AKT基因及PI3K抑制剂LY294002处理巨噬细胞,来验证PTEN信号通路在巨噬细胞表型改变中发挥的作用。将巨噬细胞分为5组:正常组,AngⅡ组,VO-OHpic+AngⅡ组,VO-OHpic+AngⅡ+si AKT组和VO-OHpic+AngⅡ+LY294002组。将干预后的巨噬细胞与CFs细胞共培养,观察CFs细胞纤维化标志物的变化情况;免疫荧光、Western blot、ELISA和q RT-PCR检测巨噬细胞表型的表达、细胞因子释放水平和纤维化标志物的变化情况,以及PTEN信号通路相关蛋白表达水平。本研究体内与体外实验各项指标以平均值±标准差来表示,多组间比较运用单因素方差分析和Turkey检验对数据进行多重比较。采用Graph Pad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。结果:1、体内实验:SHR大鼠心脏纤维化的情况:SHR组HW/TL和LVW/TL比值较WKY组相比升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。超声心动图示:与WKY组相比,SHR组短轴缩短率（FS）和左室射血分数（LVEF）降低,左心室舒张末内径（LVEDd）及心室收缩末内径（LVIDs）升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Masson染色显示SHR组心肌纤维化的表达水平较WKY组升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot、IHC及ELISA结果显示:与WKY组相比,SHR组的心肌组织CD80、CD86、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA和TNF-α表达水平升高,而SHR组心肌组织CD206、CD163和IL-10表达降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外,Western blot检测PTEN/PI3K/AKT信号通路显示:与WKY组相比,SHR组PI3K及AKT蛋白表达水平降低（P＜0.05）,PTEN蛋白表达水平升高（P＜0.05）,该结果表明SHR心肌纤维化的发生可能与PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。PTEN抑制剂VO-OHpic缓解SHR大鼠心肌纤维化:VO-OHpic组HW/TL和LVW/TL比值较SHR组相比降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。超声心动图示:与SHR组相比,VO-OHpic组FS和LVEF升高,而LVEDd及LVIDs降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Masson染色显示SHR组心肌纤维化的表达水平较SHR组升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot、IHC及ELISA结果显示:与SHR组相比,VO-OHpic组心肌组织CD80、CD86、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA和TNF-α表达水平降低,而CD206、CD163和IL-10表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外,Western blot检测PTEN/PI3K/AKT信号通路显示:与SHR组相比,VO-OHpic组心肌组织PI3K及AKT蛋白表达水平升高（P＜0.05）,而PTEN蛋白表达水平降低（P＜0.05）。2、体外实验:Western blot和IF显示,与对照组相比,AngⅡ组巨噬细胞的CD80和CD86表达水平升高,而CD163和CD206表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与AngⅡ组相比,VO-OHpic+AngⅡ组巨噬细胞的CD80和CD86表达水平降低,而CD163和CD206表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。ELISA和q RT-PCR显示:与AngⅡ组相比,VO-OHpic+AngⅡ组巨噬细胞的TNF-α和IFN-γ表达水平降低,而IL-10表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。为进一步验证PTEN信号通路在心肌纤维化中发挥的作用,予以巨噬细胞AKT基因敲除（si AKT）和PI3K抑制剂（LY294002）干预,结果如下:与VOOHpic+AngⅡ组相比,VO-OHpic+AngⅡ+si AKT组和VO-OHpic+AngⅡ+LY294002组巨噬细胞的CD80、CD86、TNF-α和IFN-γ表达水平升高,而CD163、CD206和IL-10表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测PTEN信号通路显示,与AngⅡ组、VO-OHpic+AngⅡ+si AKT组和VO-OHpic+AngⅡ+LY294002组相比,VO-OHpic+AngⅡ组巨噬细胞的PI3K和AKT蛋白表达水平升高,而VO-OHpic+AngⅡ组巨噬细胞PTEN蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。将上述处理的巨噬细胞与CFs细胞进行共培养。Western blot、IF及ELISA检测结果显示:与对照组共培养的CFs细胞相比,AngⅡ组共培养的CFs细胞的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、TGF-β和Smad 2/3蛋白表达水平明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与AngⅡ组共培养的CFs细胞相比,VO-OHpic+AngⅡ组共培养的CFs细胞的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、TGF-β和Smad 2/3蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与VO-OHpic+AngⅡ组共培养的CFs细胞相比,VO-OHpic+AngⅡ+si AKT组及VO-OHpic+AngⅡ+LY294002组共培养的CFs细胞的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA、TGF-β和Smad 2/3蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:PTEN信号通路可能参与高血压所致的心肌纤维化的形成,这一过程与巨噬细胞表型变化有关。其中,PTEN抑制剂VO-OHpic通过PI3K/AKT/TGF-β/Smad 2/3信号通路（上调PI3K和AKT蛋白水平的表达,下调TGF-β和Smad2/3蛋白水平的表达）,增加M2型巨噬细胞表型的表达和抗炎症因子的释放水平,从而改善高血压所致的心肌纤维。背景:基于第一部分的研究,我们证实PTEN/磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路（PTEN/PI3K/AKT信号通路）可以改善高血压所致的心肌纤维化。我们团队前期研究显示青中年女性高血压患者中有60.4%存在性功能障碍,而这一比例在血压正常女性仅有26%。因为高血压可以导致全身血管重构及动脉硬化,导致生殖器血管的管腔变窄,血流阻力升高,最终出现性欲下降和性功能障碍,故我们提出,性器官也应该视为女性高血压靶器官之一。我们团队前期临床研究表明非洛地平联合厄贝沙坦与非洛地平联合美托洛尔的降压效果相似,而非洛地平联合厄贝沙坦治疗可以改善女性高血压患者性功能,这一过程与改善性激素水平和降低氧化应激水平有关。我们进一步在动物研究中发现厄贝沙坦对SHR大鼠阴道纤维化和阴道血管重塑具有改善作用。基于我们团队对血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂类药物的研究,本研究进一步探索血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（ARNI）对高血压所致女性性功能障碍的影响。沙库巴曲缬沙坦（SAC/VAL）属于血管紧张素Ⅱ受体和脑啡肽酶双重阻滞剂类药物,在治疗高血压所致的心脏损害和心力衰竭方面优于VAL,前者可能对女性高血压性功能障碍也有益处。脑啡肽酶（NEP）是SAC的主要靶点,是一种膜结合的循环酶。NEP可以将内源性PTEN招募至细胞膜上,延长PTEN蛋白的稳定性,增加PTEN磷酸酶的活性。SAC是NEP抑制剂,可以通过降低PTEN表达水平从而减少心肌细胞的凋亡、缓解心肌纤维化和改善受损心肌的收缩功能。已有研究表明PTEN表达水平的变化在维持表皮层状鳞状上皮和上皮细胞的稳态起到关键作用,且阴道上皮与层状鳞状上皮相似。PTEN/PI3K/AKT信号通路可调控卵泡的激活、生长和分化,但此信号通路在阴蒂和阴道组织中纤维化的作用尚不清楚。本研究假设SAC/VAL改善雌性SHR大鼠性功能障碍和性器官纤维化,可能与激活PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。目的:研究SAC/VAL对雌性自发性高血压大鼠（SHR）的阴道和阴蒂组织的纤维化表达水平、发情周期和性行为表达的影响。探讨SAC/VAL对SHR大鼠阴蒂和阴道组织中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平的变化情况。方法:本实验分体内和体外实验两部分:1、体内实验:选择30只30周龄的雌性SHR大鼠,随机分成3组:SHR组（n=10）、VAL组（30 mg/kg/day,灌胃,n=10）和SAC/VAL组（60 mg/kg/day,灌胃,n=10）。选择10只正常血压的雌性WKY大鼠为对照组。测量每组大鼠干预前及干预后的血压水平。通过阴道涂片评估雌性大鼠的发情周期,选取发情期的大鼠进行性行为的评估,包括大鼠的性行为接受度、性感知程度和攻击程度。处死发情期的大鼠后,通过苏木素伊红（H＆E）染色和Masson染色观察大鼠阴道和阴蒂组织的上皮厚度、血管壁/血管腔比值和纤维化面积。Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估阴道和阴蒂组织中纤维化标志物[包括胶原（Col）-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）]表达水平及性激素（包括雌激素和雄激素）表达水平。Western blot检测不同组间大鼠阴道和阴蒂组织中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平。2、体外实验:选用阴道上皮细胞VK2/E6E7进行实验。将阴道上皮细胞分为四组:对照组、AngⅡ组、AngⅡ+VAL组和AngⅡ+SAC/VAL组,并采用Western blot方法评估PTEN/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平。体内实验中所得的数据用平均值±标准误差表示。体外实验中所得的数据用平均值±标准差表示。根据高斯分布分析,性行为和性周期数据用Kruskal-Wallis方差进行分析。其他数据符合正态分布,选择单因素方法分析和Tukey分析进行数据处理。所有的数据分析均使用Graph Pad 8.0进行。结果:1、体内实验:雌性SHR大鼠性功能障碍的情况:SHR组收缩压和舒张压较WKY组相比升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。大鼠阴道涂片和动物性行为检测表示:SHR组发情周期、发情期、性行为接受度和性感知度较WKY组相比降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。H＆E染色和Masson染色评估大鼠阴蒂和阴道组织结构显示:与WKY组相比,SHR组阴蒂和阴道组织上皮厚度变薄,而血管壁/血管腔比值及间质纤维化面积增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot和ELISA结果表明,与WKY组相比,SHR组阴蒂和阴道组织的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-SMA蛋白表达水平升高,而雌二醇、雌激素受体α、雌激素受体β和雄激素表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白质示:与WKY组相比,SHR组阴蒂和阴道组织的PI3K和AKT蛋白表达水平降低,而PTEN蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）。SAC/VAL和VAL改善雌性SHR大鼠性功能障碍:SAC/VAL组和VAL组收缩压和舒张压较SHR组相比降低,且SAC/VAL组与VAL组相比降低更显著,差异具有统计学意义（P＜0.05）。大鼠阴道涂片和动物性行为检测表示:SAC/VAL组和VAL组发情周期、发情期、性行为接受度和性感知度较SHR组相比升高,SAC/VAL组较VAL组相比升高显著,差异具有统计学意义（P＜0.05）。H＆E染色和Masson染色评估大鼠阴蒂和阴道组织结构显示:与SHR组相比,SAC/VAL组和VAL组阴蒂和阴道组织上皮厚度变厚,而血管壁/血管腔比值及间质纤维化面积降低,且SAC/VAL作用要优于VAL,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot和ELISA结果表明,与SHR组相比,SAC/VAL组和VAL组阴蒂和阴道组织的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和α-SMA蛋白表达水平降低,而雌二醇、雌激素受体α、雌激素受体β和雄激素表达水平升高,且SAC/VAL作用要优于VAL,差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白质表达示:SAC/VAL组和VAL组阴蒂和阴道组织的PI3K和AKT蛋白表达水平与SHR组相比升高,PTEN蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2、体外实验:Western blot检测PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白质示:与对照组相比,AngⅡ组PTEN蛋白表达水平明显增高,PI3K和AKT蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。而AngⅡ+VAL组和AngⅡ+SAC/VAL组的PTEN蛋白表达水平较AngⅡ组相比明显降低,PI3K和AKT蛋白表达水平较AngⅡ组相比增高,且SAC/VAL干预后PTEN通路变化较VAL相比更为显著,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论:SAC/VAL可改善雌性SHR大鼠性功能和性器官组织的纤维化,其作用效果要优于VAL,这可能与激活PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）是具有蛋白质和脂质双重活性的磷酸酶。PTEN作为一个重要的第二信使调节信号,可以去磷酸化磷脂酰肌醇3,4,5-磷酸（PIP3）,降低其表达水平。当心肌细胞受损时,PIP3激活并聚集在心肌细胞的细胞质中微囊和脂质内,改善受损心肌细胞的结构和功能。PTEN通过修饰半胱氨酸的活化位点对心肌细胞进行氧化还原反应,反之,PTEN表达水平也受心肌细胞核内转录和翻译过程的影响。PTEN负向调节磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路,与心肌细胞、心脏成纤维细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞的增殖有关,参与心脏收缩功能障碍、心肌肥厚及心脏扩大的发生及发展过程。PTEN/PI3K/AKT信号通路可介导多种细胞的生理和病理反应。其中,Ⅰ类PI3K可以被酪氨酸激酶受体（RTK）/细胞因子受体（ⅠA类）激活或G蛋白偶联受体（GPCR,ⅠB类）激活。激活的PI3K会产生磷脂酰肌醇（Ptdlns）（3,4,5）P3,导致蛋白激酶B、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1和单体G蛋白的激活和聚集,随后激活一系列的下游靶点,包括糖原合成酶激酶3β、哺乳动物的雷帕霉素靶点、内皮型一氧化氮合酶和抗凋亡的效应器等。PTEN可以调控心脏中ⅠA类（PI3Kα、β和δ）和ⅠB类PI3K的表达。PTEN过表达可以降低Ptdlns（3,4,5）P3表达水平,而PTEN表达水平的降低会使体内Ptdlns（3,4,5）P3积聚。PTEN/PI3K/AKT信号通路对心脏生理学及病理学具有级联反应。本篇综述主要探讨PTEN/PI3K/AKT信号通路的生物化学和分子特性在心血管疾病中的作用。