随着糖尿病发病率逐年上升,4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine,4-HIL）作为传统降血糖中药葫芦巴种子中的有效成分,引起人们的关注。目前应用于4-HIL工业化生产的种子提取法效率低下,很难满足市场需求。针对现有发酵法生产4-HIL存在的周期长、菌株生长缓慢等不足,本研究以大肠杆菌作为出发菌株,通过系统代谢工程构建了一株4-HIL生产菌。主要研究内容如下:（1）4-HIL合成途径的构建。构建重组质粒p Trc99a-ido导入到大肠杆菌W3110中,获得重组菌株W3110-IDO。外源添加底物异亮氨酸和α-酮戊二酸,在未优化条件下异亮氨酸的转化率为87%。由此可见,大肠杆菌W3110可以作为宿主,进行4-HIL生产菌的构建。将重组质粒p Trc99a-ido导入到前期初步构建的异亮氨酸生产菌W3110-Ile中构建4-HIL合成途径,实现内源异亮氨酸到4-HIL的一步转化。摇瓶发酵结果表明,该菌株经24 h发酵,4-HIL产量为8.4 g/L。（2）强化异亮氨酸合成。为促进异亮氨酸的合成,过表达解除反馈抑制的异亮氨酸合成途径中的关键酶编码基因。首先,过表达了苏氨酸脱水酶的编码基因ilv A,促进苏氨酸到2-酮丁酸的转化。摇瓶发酵显示,4-HIL的产量为10.3 g/L,提高23.1%,异亮氨酸剩余4.2 g/L。在此基础上,过表达了thr ABC操纵子,促进天冬氨酸到苏氨酸的转化。摇瓶发酵显示,4-HIL产量为11.8 g/L,提高16.7%,异亮氨酸剩余4.1g/L。（3）重构中心代谢途径。推测异亮氨酸不能完全转化为4-HIL的原因是α-酮戊二酸的供应不足。为增加α-酮戊二酸的供应,敲除异柠檬酸裂解酶编码基因ace A阻断乙醛酸循环,获得的菌株HIL04,经24 h发酵,4-HIL产量为12.2 g/L。为减少α-酮戊二酸的消耗,分别敲除α-酮戊二酸脱氢酶复合物（α-ketoglutarate dehydrogenase complex,ODHC）和琥珀酰-Co A合成酶的编码基因suc AB和suc CD。结果表明,获得的菌株HIL05和HIL06的生长及4-HIL产量大幅度下降。（4）精准调控TCA循环。为平衡菌株生长和4-HIL合成,分别采用弱化和动态调控策略调节suc AB转录。比较了5种弱启动子调节suc AB转录对4-HIL合成的影响,结果表明P107启动子效果最佳,4-HIL产量为14.3 g/L。采用CRISPRi策略干扰suc AB转录,但菌株生长和4-HIL合成显著下降。采用自调节启动子Pflic动态调节suc AB转录,所获菌株HIL16的4-HIL产量达到14.9 g/L,提高32.6%,且无异亮氨酸剩余。本研究以大肠杆菌为宿主,通过系统代谢工程策略,获得一株生长快、无营养缺陷的4-HIL生产菌株,可为其他氨基酸衍生物合成菌株的代谢工程构建提供依据。