论文部分内容阅读
目的:乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒持续感染的关键因子,为了研究肝癌发生过程中宿主对病毒cccDNA的调控,我们检测了HCC样本中配对的癌组织和癌旁组织中HBV cccDNA的表达水平,并进一步分析了宿主抗病毒因子APOBEC家族基因与HBV cccDNA的相关性。 方法:首先通过特异性荧光定量PCR方法检测了49例配对的癌组织及癌旁组织中肝脏内HBV cccDNA和HBV total DNA的表达水平,并用配对秩和检验的方式分析其表达差异;然后应用滚环扩增技术特异性扩增这49对癌组织及癌旁组织中肝脏内HBV cccDNA,测序后分析HBV基因组的4个编码调控区域preC/C, RT, X, preS中病毒cccDNA发生的突变,进一步应用3D-PCR深入比较癌组织和癌旁组织中cccDNA发生的G-A突变。通过 RT-qPCR检测了APOBEC3B家族在这49对癌组织及癌旁组织中肝脏内的表达差异,并通过Western Blot进行验证。最后在细胞体系中, HepAD38细胞中过表达APOBEC3B质粒,研究其对cccDNA潜在的抑制作用。 结果:在49例患者中,在35例配对的癌组织和癌旁组织都检测到了cccDNA,癌组织HBV cccDNA平均表达水平显著低于癌旁组织中(p=0.003),同时肝脏内HBV cccDNA与HBV total DNA的表达水平呈正相关性。通过滚环扩增,我们分析了 HBV cccDNA编码preC/C和X区,发生G-A的突变最高,进一步用3D-PCR发现癌组织 cccDNA的 preC/C区主要发生 G-A突变,突变率高于癌旁组织(3.9/1000bp vs0.12/1000bp),并且更多的G-A突变发生于GpA二联核苷酸形式,表明APOBEC3可能参与了HCC中 cccDNA的剪切和降解。最后我们分析了APOBEC3家族7个基因在肿瘤组织和癌旁组织中的转录水平:APOBEC3A、 APOBEC3B和APOBEC3D在癌组织中上调,而APOBEC3C、APOBEC3F、APOBEC3G和 APOBEC3H在癌组织下调,其中 APOBEC3B在癌组织的表达上调具有显著性差异(P<0.05)。HepAD38细胞中过表达APOBEC3B,通过特异性荧光定量发现相对于对照组,转染 APOBEC3B表达质粒后,其 HBV cccDNA水平降低,APOBEC3B对HBV cccDNA抑制率到达42.1%。 结论:肿瘤中HBV cccDNA表达水平发生明显降低,同时发生了较多的G–A突变,这种变化可能是由于肿瘤中APOBEC3B基因表达上调引起。