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目的： 研究微流控技术制备载骨髓间充质干细(bone mesenchymal stem cell，BMSC)海藻酸微球的技术方法;探索载BMSC海藻酸微球与磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)复合的可行性，为此类骨修复材料发展策略提供新的依据。 方法： 1.利用微流控技术制备荧光海藻酸微球及载BMSC海藻酸微球，观察其形态并探索其包裹的BMSC的存活、增殖情况和成骨分化潜能 全骨髓差速贴壁法分离培养、纯化SD大鼠BMSC;制作微流芯片，通过微流控技术制备荧光海藻酸微球及载BMSC海藻酸微球。 显微镜下观察荧光海藻酸微球的形态、分布情况;设对照组(BMSC组)、多细胞微球组（M-BMSC-Gel组）、单细胞微球组（S-BMSC-Gel组），利用光学显微镜观察微球的形态，测量微球的最大直径和面积;利用激光共聚焦与倒置荧光显微镜观察微球中BMSC生长状况，通过Live/Dead染色观察BMSC的存活情况;利用CCK-8检测BMSC的代谢活性，及通过DAPI细胞核染色观察微球中BMSC的增殖情况;通过ALP活性检测、茜素红染色、SEM观察及能谱分析、RT-PCR检测海藻酸微球包裹BMSC后，BMSC的成骨分化能力。 2.载BMSC海藻酸微球/CPC复合的初步研究 按2.5g∶1ml的粉水比制备CPC浆料，将BMSC海藻酸微球接种在CPC浆料表面，通过Live/Dead染色的方法观察CPC浆料对海藻酸微球包裹的BMSC的毒性作用。 CPC与水按2.5g∶1ml的质量体积比调拌为A组（CPC组）、CPC与海藻酸微球悬液分别按2.5g∶1ml、2g∶1ml、1.5g∶1ml质量体积比调拌，分别为B组（2.5gCPC/1mlGel组）、C组（2gCPC/1mlGel组）、D组(1.5gCPC/1mlGel组)。将四组浆料分别装入5ml注射器，每组3个样品，利用万能测试机对样品轴向施压，称量浆料注射前后的质量，计算挤出率;将四组浆料分别装入模具，每组6个样品，37℃固化24h后脱模，利用万能测试机对样品轴向施压，记录最大压力及应力应变，求出弹性模量和抗压强度;将四组浆料分别装入模具中，每组3个样品，37℃固化24h后脱模，60℃真空恒温干燥24h后，喷金、扫描电子显微镜观察样品的表面形态及孔隙大小。 结果： 1.微流控技术制备荧光海藻酸微球、载BMSC海藻酸微球，微球表面形态及其内部BMSC的存活、增殖和成骨分化潜能结果 (1)光学显微镜观察微球和微球尺寸测量结果：通过微流控技术制备的荧光海藻酸微球，显微镜下可见微球大小均匀，荧光强度、浓度相当，并呈高度分散状态;载BMSC的海藻酸微球，大小均匀，尺寸可控。BMSC多细胞海藻酸微球呈椭球形，最大直径为(163.54±4.03)μm，面积为(17343.33±341.39)μm2;BMSC单细胞海藻酸微球形状规则，呈球形，直径为(70.03±0.60)μm，面积为(3707.85±114.66)μm2。 (2)Live/Dead染色结果显示：BMSC组随着时间延长少量细胞核被染成红色，出现部分细胞凋亡的现象;BMSC多细胞微球和BMSC单细胞微球组，在1d有少量细胞核被染成红色，4d、7d、14d极少数被染成红色的细胞，但随着时间的延长绿色荧光逐渐减弱。Live/Dead染色结果统计，BMSC组随时间的延长，活细胞比例缓慢降低;BMSC多细胞和单细胞微球组1d活细胞比例低于BMSC组，P＜0.05，但活细胞比例仍然较高，达到89％以上，4d、7d、14d活细胞比例与BMSC组无明显差异，P＞0.05。 (3)CCK-8细胞代谢活性检测，结果显示：海藻酸微球包裹的BMSC在第3天相对于第1d，代谢活性较低，之后有一个上升的趋势，但明显低于未包裹的BMSC，P＜0.05;7d、9d、12d，M-BMSC-Gel组比S-BMSC-Gel组代谢活性高，P＜0.05。 (4)DAPI细胞核染色结果显示：在6d、8d可见部分微球包裹的BMSC细胞团体积变大，呈多核状态。 (5)微球包裹的BMSC的成骨分化潜能结果显示： ①显微镜下观察，BMSC组14d、21d可见明显的钙结节形成，茜素红染色呈红色深染;M-BMSC-Gel组、S-BMSC-Gel组在第7d开始可见微球包裹的细胞周围颜色较深，第14d可见整个微球沉积不透光的钙化物，21d钙化物沉积量增加。14d、21d茜素红染色呈红色，M-BMSC-Gel组比S-BMSC-Gel组颜色深，并且空凝胶球也发生矿化，被染成红色。 ②ALP活性检测结果显示：BMSC组1d-7d呈上升，7d达到峰值，14d、21d下降;M-BMSC-Gel组、S-BMSC-Gel组1d-4d升高，4d达到峰值，7d-21d下降。在4d M-BMSC-Gel组和S-BMSC-Gel组均明显高于BMSC组，P＜0.05，M-BMSC-Gel组高于S-BMSC-Gel组，P＜0.05;在7d BMSC组ALP活性高于M-BMSC-Gel组和S-BMSC-Gel组，P＜0.05。 ③扫描电镜结果显示：成骨诱导前BMSC海藻酸微球塌陷，不规则，表面光滑;成骨诱导21d、28d后BMSC海藻酸微球表面粗糙，沉积大量的钙磷盐晶体。能谱分析显示：成骨诱导前、成骨诱导21d、成骨诱导28d各组钙、磷含量随诱导时间延长而逐渐增加;相同时间点，M-BMSC-Gel组比S-BMSC-Gel组钙、磷含量多。 ④Real-time PCR检测结果显示：成骨诱导7d、14d、21d，在7d BMSC组ALP mRNA相对表达量最高，14d、21d下降，BMSC海藻酸微球组ALPmRNA表达量在7d、14d、21d表现为先下降后上升的趋势，与ALP活性检测结果趋势相符。在7d、14d、21d三个时间点BMSC海藻酸微球组OCNmRNA相对表达量明显高于BMSC组，P＜0.05;BMSC海藻酸微球组在7dOCN基因上调表达倍数为136倍，14d、21d较7d OCN基因上调表达倍数少，但仍比BMSC组高表达49倍以上。 2.载BMSC海藻酸微球/CPC复合的初步研究结果 (1)Live/Dead染色结果：在第1d CPC+BMSC-Gel组活细胞比例比BMSC-Gel组低(P＜0.05)，但是4d、7d、14d两组比较无明显差异（P＞0.05），两组BMSC随时间的延长，活细胞比例缓慢降低，但活细胞比例均高于92％。 (2)可注射性结果：CPC组挤出率为(32.19±6.53)％，2.5gCPC/1mlGel组挤出率为(7.12±0.653)％，2.0gCPC/1mlGel组挤出率为(20.51±0.855)％，1.5gCPC/1mlGel组挤出率为(43.45±0.890)％，四组之间两两比较，有明显的统计学差异，P＜0.05。 (3)力学测试结果显示：①弹性模量：2.5gCPC/1mlGel组(181.50±48.87)MPa与CPC组(188.23±48.06)MPa弹性模量相比无统计学差异，P＞0.05,2.0gCPC/1mlGel组(86.09±12.45)MPa、1.5gCPC/1mlGel组(65.40±11.20)MPa明显低于CPC组，P＜0.05。②抗压强度：2.5gCPC/1mlGel组(3.10±0.37)MPa与CPC组(3.14±0.33)MPa抗压强度比较，无明显差异，P＞0.05，2.0gCPC/1mlGel组(2.04±0.39)MPa、1.5gCPC/1mlGel组(1.30±0.29)MPa均低于CPC组，P＜0.05。 (4)扫描电镜结果：SEM观察可见CPC组样品表面粗糙、较致密，无明显的孔隙，2.5gCPC/1mlGel组有少量散在的小孔隙，2.0gCPC/1mlGel组孔隙较2.5gCPC/1mlGel组疏松，孔隙较多，1.5gCPC/1mlGel组可见明显的大孔隙，孔隙之间相互连通。 结论： (1)微流控技术制备的海藻酸微球形态规则，尺寸可控; (2)海藻酸微球不影响其包裹的BMSC的存活、成骨分化潜能; (3)在CPC固化的过程中，海藻酸微球对其包裹的BMSC有一定的保护作用; (4)载BMSC海藻酸微球/CPC复合物提高了可注射性，并且海藻酸微球对CPC有一定的致孔作用。