替加环素是一种广谱抗多重耐药革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的甘氨酰环素抗生素,尽管替加环素未被批准用于动物,但在禽源不动杆菌中已经检出替加环素耐药基因。tet（X3）基因是近年来被发现的一种替加环素耐药基因,而且能够介导对所有四环素类抗菌药物的抗性。禽类作为食品动物,在预防与治疗疾病方面也会使用不同的抗菌药物,因此也会被认为是细菌的潜在储存库,可能会对人类的公共健康造成威胁。本研究从广东佛山、珠海和江门等地的禽类养殖场采集了615份样品,样品来源分别为粪便、污水、土壤及灰尘。采用含2μg/m L替加环素的不动杆菌选择性显色培养基分离细菌,并且通过16S r RNA测序来鉴定细菌种属,采用PCR检测分离菌株中四环素类耐药基因tet（X3）。结果显示615份样品中共获得49株不动杆菌,包括2株Acinetobacter schindleri、3株Acinetobacter towneri、6株Acinetobacter rudis、13株Acinetobacter indicus、20株Acinetobacter variabilis以及5株未知菌种的不动杆菌,全部不动杆菌皆进一步证实为tet（X3）阳性。采用琼脂稀释法测定tet（X3）阳性不动杆菌原菌耐药表型,以及微量肉汤稀释法测定tet（X3）阳性不动杆菌接合子耐药表型。结果显示所有不动杆菌对替加环素、四环素、环丙沙星以及磺胺甲噁唑/甲氧苄啶耐药率为100%;此外,对氟苯尼考、氨苄西林、磷霉素和头孢噻肟的耐药率分别为69.1%、54.5%、47.3%和36.4%;而对头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星和美罗培南的耐药率分别为34.5%、32.7%、7.3%和1.8%;但是所有的菌株均对黏菌素敏感。对49株tet（X3）阳性不动杆菌进行测序并进行耐药基因的分析,结果显示共有9大类的耐药基因,其中四环素类中耐药基因tet（X3）的检出率为100%,其次为tet（39）,检出率为81.6%;大环内酯类中耐药基因mph（E）和msr（E）的检出率均为91.8%;磺胺类中耐药基因sul2的检出率为100%,其次为sul1,检出率为57.1%;氟苯尼考类中耐药基因flo R的检出率为79.6%;氨基糖苷类耐药基因中,aph（3’’）-Ib的检出率最高,为71.4%,其次为aph（3’）-Ia,检出率为69.4%;β-内酰胺类中耐药基因bla OXA-58和bla DHA-1的检出率分别为34.7%和30.6%;甲氧苄啶类中耐药基因dfr A1的检出率为24.5%,dfr A16和dfr A19的检出率均为16.3%;利福平耐药基因arr-3的检出率为34.7%;而喹诺酮类中耐药基因qnr D1的检出率为32.6%,aac（6’）-Ib-cr的检出率为26.5%。对所有菌株进行接合转移实验,结果发现有6株不动杆菌接合成功,剩余的不动杆菌全部接合失败。先对tet（X3）阳性的不动杆菌及其接合子进行S1-PFGE与I-Ceu I PFGE,接着进行Southern杂交实验。结果显示共有30株菌tet（X3）基因定位于不同大小的质粒上,质粒大小约为78～210 kb,其中有12株菌定位于78 kb左右的质粒上,有7株菌定位于104 kb左右的质粒上,有3株菌定位于138 kb左右的质粒上,还有7株菌定位于180 kb左右的质粒上,只有1株菌定位于210 kb左右的质粒上。还有25株菌tet（X3）基因定位于染色体上。对所有的菌株进行全基因组测序,然后对tet（X3）上下游的基因序列进行分析,以此来得到tet（X3）的基因环境,并同时与一完整的含有tet（X3）基因的质粒结合分析。结果显示共有5大类的基因环境（A、B、C、D、E）,其中有5株菌属于A大类,基因环境结构为IS26-tnp F-tet（X3）-par A-hp-ISCR2;有31株菌属于B大类,基因环境结构为IS26-Δtnp F-tet（X3）-par A-hp-ISCR2;有2株菌属于C大类,基因环境结构为ΔISCR2-Δtnp F-tet（X3）-par A-hp-ISCR2;有5株菌属于D大类,基因环境结构为ΔISCR2-Δtnp F-tet（X3）-par A-hp-ISCR2,且Δtnp F与tet（X3）之间出现了截断;而有6株菌属于E大类,基因环境结构为ΔISCR2-tnp F-tet（X3）-par A-hp-ISCR2。综上所述,本研究中所有的不动杆菌对兽医临床常使用的抗菌药物的耐药性问题严重,且大多数都为多重耐药菌株,而且耐药基因检出率较高。tet（X3）基因的传播与质粒、插入序列等可移动元件相关,而且抗生素的广泛使用所造成的选择压力也是促使其传播的主要动力。因此,我们应当对禽类合理使用抗生素,避免其成为重要耐药基因的潜在储存库,给公共卫生和人类健康带来危害。