近年来由于多重耐药革兰氏阴性菌的广泛流行和传播,替加环素成为治疗碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌等感染的少数有效药物之一。但随着这类药物在临床上的广泛使用,替加环素耐药问题日趋严重。替加环素耐药机制主要包括染色体介导RND外排泵过表达、Tet A突变体、核糖体蛋白突变和Tet（X）酶降解,但目前尚未发现能介导替加环素耐药的可转移的RND外排泵。本研究从5株鸡源泛耐药肺炎克雷伯菌中发现了一种位于质粒上的新型RND外排泵,可介导替加环素等多种药物耐药,并进一步分析其质粒特征和流行情况,为指导临床合理用药及新药研究提供科学的数据支撑。2017年,从安徽某鸡场获得5株泛耐药肺炎克雷伯菌（AH6I、AH8I、AH25I、AH28I和AH33I）,对替加环素的最小抑菌浓度为16μg/m L,且均属于ST1。通过检测外排泵抑制剂NMP对药物敏感性的影响,发现NMP可恢复菌株对替加环素的敏感性。随机挑选一株耐药菌AH8I进行全基因组和三代测序分析,发现该菌株携带bla NDM-1、mcr-1、mcr-8等30个耐药基因,但未检测到与替加环素耐药有关的基因突变（tet（A）、ram R、acr R和rps J）。AH8I携带5个质粒,其中一个大小为121,961bp的Inc FIA型质粒p HNAH8I-1携带一个RND外排泵基因簇,与铜绿假单胞菌染色体上的mex CD-opr J基因簇有78%的核苷酸序列同源性,将其命名为tmex CD1-topr J1。氨基酸序列分析结果显示,TMex C1、TMex D1和TOpr J1与Mex C、Mex D和Opr J具有64.5%～77.8%的氨基酸同源性。将tmex CD1-topr J1片段克隆至低拷贝载体并转移至肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门氏菌中,确定该外排泵能够介导甘氨酰环素类（替加环素）、四环素类、喹诺酮类、头孢菌素类和氨基糖苷类等多种药物耐药（MIC提高4～32倍）,这意味着tmex CD1-topr J1也是一种新的质粒介导的喹诺酮耐药基因。通过接合与转化实验成功将替加环素耐药性质粒p HNAH8I-1转移到受体菌中,接合频率约10-6～10-7。tmex CD1-topr J1基因环境分析结果显示其位于编码位点特异性整合酶的两个基因附近,推测其可能通过假定整合酶从某种假单胞菌染色体捕获并转移到质粒。小鼠感染模型的替加环素治疗实验结果显示,接种tmex CD1-topr J1阳性肺炎克雷伯菌的小鼠死亡率更高,提示其可能会导致临床治疗失败。细菌生长曲线实验结果表明,tmex CD1-topr J1能显著降低大肠杆菌和沙门氏菌的生长,但不影响肺炎克雷伯菌的生长。对原菌AH8I和接合子进行稳定性实验,发现p HNAH8I-1在肺炎克雷伯菌中能稳定存在,但在大肠杆菌J53中在连续传代15天后质粒丢失率为29%。为进一步了解tmex CD1-topr J1的流行情况,从国内10个省的鸡场、猪场和农贸市场采集了2,326份鸡泄殖腔样品、142份猪直肠拭子样品、643份鸡盲肠样品和699份零售肉样品（347份鸡肉和352份猪肉）,采用PCR方法检测样品中的tmex CD1-topr J1。结果显示,鸡源样品检出率为14.3%,零售肉样品检出率为3.4%,主要分布在肺炎克雷伯菌中,在产酸克雷伯菌和植生拉乌尔菌中也有发现。另外对2016年～2018年从国内15个省18家三甲医院分离的2,575株肺炎克雷伯菌进行tmex CD1-topr J1检测,结果检出率为0.08%,说明tmex CD1-topr J1主要在鸡源样品中广泛传播。综上所述,我们首次发现了介导替加环素耐药的可转移多重耐药RND外排泵基因簇tmex CD1-topr J1,tmex CD1-topr J1位于可接合转移Inc FIA型质粒上,与位点特异性整合酶相邻。tmex CD1-topr J1已在鸡源样品中广泛存在,主要由肺炎克雷伯菌携带。尽管tmex CD1-topr J1在人源菌中检出率较低,但考虑到tmex CD1-topr J1的可转移性和外排泵底物的广泛性,tmex CD1-topr J1可能会进一步传播,威胁人类健康。因此,需要采取措施来监测和控制其进一步蔓延。