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ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将L-赖氨酸单体通过α-COOH与ε-NH2脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为25-35。由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、作用pH广、热稳定强等特点，ε-PL已被广泛用作食品防腐剂。此外，ε-PL还被用于食疗剂、药物载体、基因芯片、电子材料等领域。因此，其应用价值及市场前景是非常广阔的。本论文首先从土壤中筛选获得了五种野生型的ε-PL产生菌；其次利用传统诱变方法及新兴的Genome Shuffling技术对这些野生菌株进行育种改造，以提升其ε-PL发酵水平；然后对获得的高产菌株进行了种间随机的原生质体融合，将其优良性状集中于同一个细胞内，进一步提升了ε-PL的产量；最后对种间融合获得的高产杂合子产ε-PL进行了强化，包括Genome Shuffling、培养基优化及发酵工艺优化，最终使其ε-PL产量达到了国内领先水平。具体研究内容如下：（1）从土壤中筛选放线菌时，为了有效抑制杂菌（细菌、霉菌）的生长，在分离培养基中添加了复合抑制剂：重铬酸钾30mg/L、青霉素2mg/L、氟哌酸3mg/L、制霉菌素80mg/L；对ε-PL产生菌的筛选方法做了改进，利用“双层琼脂法”代替“直接添加美蓝”法，将“菌落生长”与“排斥美蓝显色”分成了两个阶段，能够有效避免美蓝对微生物的毒害，提高了筛选效率；利用该法从土壤中筛选获得了ε-PL产生菌42株，其中至少有白色链霉菌S. albulus、禾粟链霉菌S. graminearus、吸水链霉菌S. hygroscopicus、灰褐链霉菌S. griseofuscus、稠李链霉菌S. padanus等五种菌株，其中后四种菌株在ε-PL产生菌中未见报道。（2）采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）对五种ε-PL产生菌进行诱变。UV诱变剂量为：功率8W，距离30cm照射4min。NTG诱变剂量为0.5mg/mL处理70min；选择了五种物质作为“筛子”：葡萄糖、ε-PL、KH2PO4、磺胺胍、琥珀酸为唯一碳源，确定了其（除琥珀酸）对野生菌株的临界浓度分别为：190g/L、0.06g/L、30g/L、20g/L，并复合以0.05g/L的LiCl；开展大批量的诱变及筛选工作，摇瓶发酵筛选得到了其中四种菌株（S. albulus、S. graminearus、S. griseofuscus、S. padanus）三种“筛子”（葡萄糖、磺胺胍、琥珀酸为唯一碳源）的ε-PL产量提高株，由0.38-0.49g/L提高到0.50-0.72g/L，并将其作为后续Genome Shuffling的出发菌株。（3）在获得“丝状”菌体的前提下，优化了原生质体制备、再生及融合的条件为：0.5%的溶菌酶、酶解温度30℃、酶解时间120min、促融剂PEG6000浓度30%（W/V）、融合过程为37℃保温10min；采取双亲灭活法进行原生质体融合，灭活条件为：紫外线（8W，30cm）照射60min、70℃水浴40min；对四种菌株（S. albulus、S. graminearus、S. griseofuscus、S. padanus）三种“筛子”（葡萄糖、磺胺胍、琥珀酸为唯一碳源）的突变株进行了三轮Genome Shuffling育种，获得了不同菌株不同“筛子”的ε-PL产量提高株，由0.38-0.49g/L提高至0.75-0.82g/L；选取其中的两株融合子GRF3-4、PAF3-2及其野生菌株进行补料分批发酵，融合子在控制pH的扩大培养中ε-PL产量由7-8g/L（野生型）提高到13-15g/L；融合子与野生菌相比，代谢途径中一些关键酶（HK、PK、PEPC、AK、CS）的活性提高，这是导致ε-PL合成能力增强的初步原因；经过诱变及GenomeShuffling育种，菌株的16S rDNA序列会发生极少碱基的变化，但不会引起菌种分类地位的改变。（4）对Genome Shuffling育种获得的高产融合子S. albulus（葡萄糖、琥珀酸为唯一碳源）、S. graminearus（葡萄糖、磺胺胍）、S. griseofuscus（葡萄糖、琥珀酸为唯一碳源）、S. padanus（磺胺胍、琥珀酸为唯一碳源）、以及S. hygroscopicus的野生型，共包含39株菌在内的五种菌株进行两两的种间原生质体融合育种，在杂合子中没有筛选到ε-PL产量有大幅提高的菌株；将以上所有菌株混合后进行五种菌株的种间随机融合，获得了一株高产杂合子Streptomyces sp. FEEL-1，摇瓶产量为1.1g/L，比亲株提高了37%以上；随机引物扩增多态DNA（RAPD）结果初步表明菌株FEEL-1的亲本为S. albulus、S.griseofuscus与S. padanus；杂合子Streptomyces sp. FEEL-1在控制pH的补料分批发酵中ε-PL产量达到24.5g/L，比其亲本提高了40-70%；胞内酶活（HK、PK、PEPC、AK、CS）的提高是ε-PL产量提高的初步原因，也证明了种间随机融合的有效性。（5）以S-2-氨乙基-L-半胱氨酸（AEC）作为抗性指标，对杂合子Streptomyces sp. FEEL-1进行了EMS诱变及三轮Genome Shuffling育种，获得了一株Streptomyces sp. FEEL-G67，其天冬氨酸激酶AK的酶活提高了1.07倍，ε-PL摇瓶产量提高至1.73g/L，补料分批发酵产量达到29.82g/L；利用PB-CCD的响应面方法对其发酵培养基（M3G）作了优化，发现对Streptomyces sp. FEEL-G67摇瓶发酵影响显著的三个因素为：酵母粉、K2HPO4、MgSO4，且最终优化出的培养基为（g/L）：葡萄糖50，酵母粉7.5，（NH4）2SO45，K2HPO4·3H2O2.5，MgSO4·7H2O2，ZnSO4·7H2O0.04，FeSO4·7H2O0.03。在该条件下，ε-PL摇瓶产量从1.73g/L提高到2.32g/L，补料分批发酵产量达到32.25g/L；基于对pH的发酵工艺优化，证实了高pH有利于菌体生长，而低pH有利于ε-PL的合成。以最大ε-PL比合成速率为目标，提出了两阶段pH控制策略（pH3.8-4.0），在该条件下进行补料分批发酵可使ε-PL达到36.79g/L；在此基础上流加有机氮源（酵母粉），不仅使生物量达到49.7g/L，也进一步使ε-PL产量提升至41.24g/L，这是目前国内ε-PL发酵的最高水平。