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去整合素金属蛋白酶12（A Disintegrin And Metalloproteinase12，ADAM12）是去整合素蛋白酶家族的一员，具有典型的蛋白水解酶功能。它有两种构型:穿膜全长型ADAM12L和分泌型ADAM12S。研究发现，ADAM12在小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)组织中高表达，在SCLC患者的血清和尿液中显著高于正常人，并与SCLC患者的生存率呈负相关。ADAM12S可以促进SCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，但其具体作用机制尚不清楚。本论文旨在寻找ADAM12S在SCLC细胞中调控的蛋白以及潜在水解底物，以期阐明其促进SCLC细胞增殖和转移的分子机制。
第一部分 定量蛋白组学和生化方法发现ADAM12S促进SCLC细胞增殖和转移的新机制
目的:在SCLC细胞株中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定，寻找ADAM12S影响SCLC细胞增殖和转移的关键蛋白。
方法:qRT-PCR方法检测不同SCLC细胞株中ADAM12S的mRNA水平，筛选出低表达和高表达的细胞株;利用慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1构建ADAM12S过表达质粒，包装慢病毒、侵染ADAM12S低表达的H1688细胞株，利用流式细胞分选仪筛选稳定表达ADAM12S/ZsGreen和ZsGreen对照细胞株;CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验研究ADAM12S对H1688细胞增殖和转移的影响;采用细胞培养稳定同位素标记氨基酸(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)技术标记对照组和ADAM12S过表达组细胞，用Orbitrap质谱仪分析酶解的多肽组份，用蛋白质分析软件MaxQuant搜索数据库鉴定蛋白质，根据SILAC标记获得各个蛋白质在两个样品中的相对丰度，获得SCLC细胞中ADAM12S过表达后显著变化的蛋白;利用DAVID数据库分析ADAM12S调控的蛋白，分析ADAM12S所参与的生物学功能以及胞内信号通路;Western Blotting(WB)验证质谱获得的差异较大且与细胞增殖、迁移和侵袭相关的调控蛋白;qRT-PCR方法验证质谱鉴定上调的Ⅰ型己糖激酶（HexokinaseⅠ，HK1）的mRNA水平;WB方法检测HK1转录因子c-Myc的蛋白水平以及上游通路Akt/ERK的蛋白和磷酸化水平;在高表达ADAM12S的细胞株中用siRNA敲低ADAM12S观察HK1的变化;siRNA敲低HK1后观察ADAM12S对细胞增殖、迁移和侵袭的影响;构建敲低HK1的shRNA慢病毒质粒，在稳定过表达ADAM12S的H1688细胞株中敲低HK1，进行克隆形成实验;同时在shRNA稳定敲低HK1的细胞株中检测细胞的乳酸代谢和葡萄糖摄取能力。
结果:通过三次生物学重复和定量分析共鉴定到了70个ADAM12S调控的蛋白，并对这些调控蛋白进行生物学功能分析，发现其中许多蛋白参与三羧酸循环、糖异生、糖酵解等代谢途径。生物化学方法验证了微囊蛋白1(Caveo1in-1，CAV1)、半胱氨酸甘氨酸丰富蛋白1（Cysteine and glycine-rich protein1，CSRP1）、膜联蛋白A6（Annexin A6，ANXA6）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(Aspartate aminotransferase，GOT1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate1-dehydrogenase，G6PD)以及HK1等蛋白与ADAM12S的调控关系，与质谱结果一致，均被ADAM12S上调。在多种与代谢相关的蛋白中，发现糖酵解途径关键限速酶HK1与肿瘤的发生发展密切相关。在H1688细胞株中过表达ADAM12S后，HK1mRNA水平和蛋白水平均显著上调，而HK2没有上调趋势;在H446细胞中敲低ADAM12S，HK1蛋白水平下调;乳酸代谢和葡萄糖摄取实验结果显示，过表达ADAM12S，乳酸代谢和葡萄糖摄取均上调，但敲低HK1后，上调作用被明显抑制。增殖、迁移和侵袭实验表明，当敲低HK1后，ADM12S引起的增殖、迁移和侵袭均下降，而且ADAM12S对克隆形成的促进作用也被显著抑制。我们还发现ADAM12S可以上调HK1的转录因子c-Myc的mRNA水平以及蛋白水平;我们检测了c-Myc上游的Akt和ERK通路，发现ADAM12S上调Akt的磷酸化水平。
结论:通过SILAC定量蛋白质组学方法在SCLC细胞中共鉴定了70种ADAM12S调控的蛋白;并且通过生物化学方法证实部分蛋白与ADAM12S的调控关系。ADAM12S通过上调HK1，促进SCLC细胞的增殖、迁移、侵袭以及克隆形成，激活HK1依赖的有氧糖酵解。同时，ADAM12S可能是通过PI3K/Akt/c-Myc途径影响HK1的表达，进而影响SCLC细胞的增殖和转移。
第二部分 SPECS方法在分泌蛋白组中鉴定ADAM12S调控糖蛋白
目的:在SCLC细胞的分泌蛋白组中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定，以期寻找影响SCLC细胞增殖和转移的糖蛋白，并期望从中鉴定到ADAM12S潜在的水解底物。
方法:本课题中采用点击糖富集分泌组蛋白(Secretome protein enrichment with click sugars，SPECS)方法富集培养基上清中的糖蛋白。用Ac4ManNAz培养细胞，将叠氮标记到糖蛋白分子上，通过分泌或切割方式释放到培养基上清中。收集培养基上清，超滤浓缩收集蛋白，将未参加反应的Ac4ManNAz滤去，将叠氮标记的糖蛋白与Sulfo-DBCO-Biotin进行点击化学反应，将生物素标记到糖蛋白分子上，超滤除去多余的Sulfo-DBCO-Biotin分子。收集超滤管中的糖蛋白，利用NeutrAvidin与生物素的强亲和力纯化糖蛋白。我们首先优化了该方法的多个实验步骤，然后进行大样品富集，对纯化的蛋白样品进行电泳分离及银染检测，切胶后进行胶内酶解，酶解多肽经C18ZipTip除盐后，进行LC-MS/MS分析。将得到的原始质谱数据用Proteome Discoverer进行非标记定量蛋白质组学分析，获得ADAM12S在分泌蛋白组中调控的蛋白。
结果:优化了SPECS方法，并通过三次SPECS生物学重复和定量分析方法在SCLC细胞上清中鉴定到了ADAM12S显著调控的67种分泌蛋白和膜蛋白，预测其中有17种是ADAM12S潜在的水解底物，如腓骨蛋白2（Fibulin-2，FBLN2）、生长分化因子6（Growth differentiation factor6，GDF6）、维生素K依赖蛋白C（Vitamin K-dependent protein C，PROC）、分泌型磷蛋白1(Secreted phosphoprotein-1，SPP1)、黑色素瘤细胞黏附分子(Melanoma cell adhesion molecule，MCAM，又名CD146)等。我们对质谱数据中变化较大的SPP1以及CD146进行了深入分析，发现ADAM12S切割SPP1和CD146对于肿瘤的增殖和转移具有重要的生物学意义。
结论:优化了SPECS方法，并成功富集了SCLC细胞分泌蛋白组的糖蛋白，鉴定了17种ADAM12S潜在的水解底物。既推进了SPECS方法在分泌蛋白组学中的应用，也为ADAM12S的生物学功能研究提供了前期的研究基础。
第一部分 定量蛋白组学和生化方法发现ADAM12S促进SCLC细胞增殖和转移的新机制
目的:在SCLC细胞株中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定，寻找ADAM12S影响SCLC细胞增殖和转移的关键蛋白。
方法:qRT-PCR方法检测不同SCLC细胞株中ADAM12S的mRNA水平，筛选出低表达和高表达的细胞株;利用慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1构建ADAM12S过表达质粒，包装慢病毒、侵染ADAM12S低表达的H1688细胞株，利用流式细胞分选仪筛选稳定表达ADAM12S/ZsGreen和ZsGreen对照细胞株;CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验研究ADAM12S对H1688细胞增殖和转移的影响;采用细胞培养稳定同位素标记氨基酸(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)技术标记对照组和ADAM12S过表达组细胞，用Orbitrap质谱仪分析酶解的多肽组份，用蛋白质分析软件MaxQuant搜索数据库鉴定蛋白质，根据SILAC标记获得各个蛋白质在两个样品中的相对丰度，获得SCLC细胞中ADAM12S过表达后显著变化的蛋白;利用DAVID数据库分析ADAM12S调控的蛋白，分析ADAM12S所参与的生物学功能以及胞内信号通路;Western Blotting(WB)验证质谱获得的差异较大且与细胞增殖、迁移和侵袭相关的调控蛋白;qRT-PCR方法验证质谱鉴定上调的Ⅰ型己糖激酶（HexokinaseⅠ，HK1）的mRNA水平;WB方法检测HK1转录因子c-Myc的蛋白水平以及上游通路Akt/ERK的蛋白和磷酸化水平;在高表达ADAM12S的细胞株中用siRNA敲低ADAM12S观察HK1的变化;siRNA敲低HK1后观察ADAM12S对细胞增殖、迁移和侵袭的影响;构建敲低HK1的shRNA慢病毒质粒，在稳定过表达ADAM12S的H1688细胞株中敲低HK1，进行克隆形成实验;同时在shRNA稳定敲低HK1的细胞株中检测细胞的乳酸代谢和葡萄糖摄取能力。
结果:通过三次生物学重复和定量分析共鉴定到了70个ADAM12S调控的蛋白，并对这些调控蛋白进行生物学功能分析，发现其中许多蛋白参与三羧酸循环、糖异生、糖酵解等代谢途径。生物化学方法验证了微囊蛋白1(Caveo1in-1，CAV1)、半胱氨酸甘氨酸丰富蛋白1（Cysteine and glycine-rich protein1，CSRP1）、膜联蛋白A6（Annexin A6，ANXA6）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(Aspartate aminotransferase，GOT1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate1-dehydrogenase，G6PD)以及HK1等蛋白与ADAM12S的调控关系，与质谱结果一致，均被ADAM12S上调。在多种与代谢相关的蛋白中，发现糖酵解途径关键限速酶HK1与肿瘤的发生发展密切相关。在H1688细胞株中过表达ADAM12S后，HK1mRNA水平和蛋白水平均显著上调，而HK2没有上调趋势;在H446细胞中敲低ADAM12S，HK1蛋白水平下调;乳酸代谢和葡萄糖摄取实验结果显示，过表达ADAM12S，乳酸代谢和葡萄糖摄取均上调，但敲低HK1后，上调作用被明显抑制。增殖、迁移和侵袭实验表明，当敲低HK1后，ADM12S引起的增殖、迁移和侵袭均下降，而且ADAM12S对克隆形成的促进作用也被显著抑制。我们还发现ADAM12S可以上调HK1的转录因子c-Myc的mRNA水平以及蛋白水平;我们检测了c-Myc上游的Akt和ERK通路，发现ADAM12S上调Akt的磷酸化水平。
结论:通过SILAC定量蛋白质组学方法在SCLC细胞中共鉴定了70种ADAM12S调控的蛋白;并且通过生物化学方法证实部分蛋白与ADAM12S的调控关系。ADAM12S通过上调HK1，促进SCLC细胞的增殖、迁移、侵袭以及克隆形成，激活HK1依赖的有氧糖酵解。同时，ADAM12S可能是通过PI3K/Akt/c-Myc途径影响HK1的表达，进而影响SCLC细胞的增殖和转移。
第二部分 SPECS方法在分泌蛋白组中鉴定ADAM12S调控糖蛋白
目的:在SCLC细胞的分泌蛋白组中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定，以期寻找影响SCLC细胞增殖和转移的糖蛋白，并期望从中鉴定到ADAM12S潜在的水解底物。
方法:本课题中采用点击糖富集分泌组蛋白(Secretome protein enrichment with click sugars，SPECS)方法富集培养基上清中的糖蛋白。用Ac4ManNAz培养细胞，将叠氮标记到糖蛋白分子上，通过分泌或切割方式释放到培养基上清中。收集培养基上清，超滤浓缩收集蛋白，将未参加反应的Ac4ManNAz滤去，将叠氮标记的糖蛋白与Sulfo-DBCO-Biotin进行点击化学反应，将生物素标记到糖蛋白分子上，超滤除去多余的Sulfo-DBCO-Biotin分子。收集超滤管中的糖蛋白，利用NeutrAvidin与生物素的强亲和力纯化糖蛋白。我们首先优化了该方法的多个实验步骤，然后进行大样品富集，对纯化的蛋白样品进行电泳分离及银染检测，切胶后进行胶内酶解，酶解多肽经C18ZipTip除盐后，进行LC-MS/MS分析。将得到的原始质谱数据用Proteome Discoverer进行非标记定量蛋白质组学分析，获得ADAM12S在分泌蛋白组中调控的蛋白。
结果:优化了SPECS方法，并通过三次SPECS生物学重复和定量分析方法在SCLC细胞上清中鉴定到了ADAM12S显著调控的67种分泌蛋白和膜蛋白，预测其中有17种是ADAM12S潜在的水解底物，如腓骨蛋白2（Fibulin-2，FBLN2）、生长分化因子6（Growth differentiation factor6，GDF6）、维生素K依赖蛋白C（Vitamin K-dependent protein C，PROC）、分泌型磷蛋白1(Secreted phosphoprotein-1，SPP1)、黑色素瘤细胞黏附分子(Melanoma cell adhesion molecule，MCAM，又名CD146)等。我们对质谱数据中变化较大的SPP1以及CD146进行了深入分析，发现ADAM12S切割SPP1和CD146对于肿瘤的增殖和转移具有重要的生物学意义。
结论:优化了SPECS方法，并成功富集了SCLC细胞分泌蛋白组的糖蛋白，鉴定了17种ADAM12S潜在的水解底物。既推进了SPECS方法在分泌蛋白组学中的应用，也为ADAM12S的生物学功能研究提供了前期的研究基础。