肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种致命的神经退行性疾病,以身体逐渐瘫痪和运动神经元死亡为主要症状,目前仍然不能被治愈。大量研究表明,铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)的突变、氧化修饰和错误折叠及聚集与ALS疾病密切相关。目前,普遍认可的一种致病原因是正常的SOD1失稳,错误折叠或解离成单体,导致有毒中间体的形成,引发ALS疾病的发生。因此建立研究SOD1天然结构及筛选有效抑制剂的方法对治疗ALS疾病具有重要的意义。由于蛋白质复合物结构解析及蛋白-配体相互作用研究体系的复杂性,对现有分析方法提出了更高的要求。传统的生物学分析方法例如核磁共振波谱法(NMR)及X射线衍射晶体法(XRD)等技术均可对生物大分子结构进行高分辨的表征,但会受限于检测样品的大小、纯度、所需量等不同因素。因此单一依靠传统结构生物学方法已经不能对生物体内发生的动态变化和复杂的作用机制进行深入研究。与这些传统的分析方法相比,质谱(MS)方法则具有快速、灵敏度高、能提供化学计量比信息等优势,尤其是结合离子淌度(IM),能够捕捉蛋白的动态变化过程,可以弥补传统生物学手段的空白,目前已经广泛应用于结构生物学领域。本论文以天然电喷雾离子淌度质谱(Native ESI-IM-MS)技术为主要研究手段,首先利用碰撞诱导解离(CID)及碰撞诱导去折叠(CIU)质谱方法考察了正常SOD1及脱辅基超氧化物歧化酶(apo-SOD1)的结构稳定性。结果表明在同样的碰撞电压及相同含量的二硫苏糖醇(DTT)诱导的蛋白失稳条件下,apo-SOD1相较于SOD1,更易发生解离及去折叠,说明apo-SOD1结构没有SOD1稳定,金属离子是维持SOD1结构稳定性的关键因素之一。针对某些配体水溶性较差的问题,为了筛选出有效助溶剂,促进新型药物的研发,我们利用ESI-IM-MS考察了五种非质子极性溶剂对SOD1及apo-SOD1的带电荷、解离及去折叠的影响。基于CID及CIU方法的质谱结果表明:1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI),二甲基亚砜(DMSO)及N,N-二甲基甲酰胺(DMF)会使蛋白的平均电荷随着浓度的增加先减小后增大,且蛋白的二聚体含量先增加后减小,然而乙腈(ACN)及四氢呋喃(THF)对蛋白的带电荷及二聚体含量没有影响。为了进一步分析非质子极性溶剂对蛋白结构的影响,我们以DMF及apo-SOD1作为研究对象,通过降低pH值,增大锥孔电压(CV)和Trap碰撞能(Trap CE),分别考察DMF对蛋白解离和去折叠的影响。研究结果表明当DMF浓度从0%到1%时,apo-SOD1二聚体的解离和去折叠被减缓,随着浓度进一步增大至20%,蛋白结构开始变的失稳。此时蛋白的碰撞截面积先变得更加紧实随后开始慢慢去折叠,同时相应的电荷变化先减小后增大。因此推测DMF促进蛋白构象稳定可能与蛋白所带电荷减少导致的库仑斥力减少有关:另一方面,观察到溶剂加合物的形成,溶剂加合物的“蒸发冷却”效应也有利于蛋白构象的稳定,。利用天然电喷雾质谱结合离子淌度及荧光方法研究了 5-氟尿苷(5-Furd)对SOD1构象的稳定作用。离子淌度质谱的研究结果表明,5-Furd能够稳定SOD1构型。荧光光谱证明5-Furd主要通过疏水作用同SOD1结合,并且能够抑制其体外聚集。进一步借助Native ESI-IM-MS考察了三种茶多酚类化合物同SOD1的相互作用,主要通过电喷雾质谱(ESI-MS)、串联质谱(MS/MS)、竞争性结合实验及Vc5o实验评估了这三种化合物同SOD1之间的键和亲和力大小,发现epigallocatechingallate(EGCG)同SOD1的相互作用最强,离子淌度质谱研究结果表明EGCG能够减缓SOD1的去折叠,光谱实验及细胞实验结果表明其能够抑制蛋白的体外聚集,并减少细胞损伤。我们还研究了咖啡酰奎宁酸类化合物及黄烷酮类化合物与apo-SOD1的相互作用,分析了这两类化合物的结构与蛋白相互作用的构效关系。对于咖啡酰奎宁酸类化合物,结果表明二咖啡酰奎宁酸的键合亲和力要高于单咖啡酰奎宁酸,其次依次是奎宁酸、咖啡酸。说明咖啡酰基可能是活性基团,咖啡酰基数目的增加对于蛋白-配体的相互作用起到促进作用。同时建立了碱金属离子辅助离子淌度质谱区分同分异构体的方法,间接评估了二咖啡酰奎宁酸同分异构体与蛋白的键和亲和力;CIU结果进一步说明二咖啡酰奎宁酸能够稳定蛋白的二聚体结构;对于黄烷酮类化合物,ESI-IM-MS及MS/MS结果表明芹糖甘草苷的键合亲和力最强,优于相应的单糖苷及苷元,说明糖基的存在有利于提高配体与蛋白的键合亲和性。体外抑制蛋白聚集的荧光光谱实验结果与其一致;离子淌度质谱的研究结果也说明芹糖甘草苷能够减缓蛋白的去折叠,并且结合两分子芹糖甘草苷配体的蛋白减缓去折叠的程度要好于结合一分子芹糖甘草苷的配体。上述研究结果表明,天然电喷雾-离子淌度质谱是蛋白构象稳定剂及聚集抑制剂筛选的有力工具。