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大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种两栖鱼类,生活在潮间带和红树林的泥滩上,以底栖藻类和有机碎屑为食,能适应不同的温度和盐度。当暴露于空气中时,该物种有皮肤呼吸的能力。常分布在西北太平洋沿岸分布,在韩国、日本、越南和马来西亚以及中国主要沿海滩涂江苏、浙江、福建、台湾、广东、广西两省。在中国,过去的30年里,由于过度捕捞、自然栖息地破碎化或环境的破坏等原因,大弹涂鱼的种群数量锐减。目前,对大弹涂鱼各方面的研究较少,为了能更好的保护大弹涂鱼种群的延续,我们对大弹涂鱼的免疫基因进行了研究,通过研究大弹涂鱼的免疫基因,我们可以更好地了解大弹涂鱼对抗外界环境压力的方式,为后续大弹涂鱼的研究提供参考。白细胞介素(Interleukin,简称IL)是调节免疫系统的一种重要的细胞因子,本研究克隆并分析了大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因的编码区和部分非编码区,并对其基因序列和氨基酸序列进行了分析。通过建立两种基因的系统发生树,对这两种基因进行了进化分析,探究他们的进化模式。本实验还对大弹涂鱼进行了鳗弧菌感染和poly(I:C)注射实验,并以此来探究大弹涂鱼IL-1β、IL-8和IL-10基因在不同病原体刺激下的表达模式。主要结果如下:1.大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因编码区序列的克隆和分析本实验成功克隆出大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因编码区和部分非编码区序列,分析显示大弹涂鱼IL-1β基因开放阅读框(cds区)全长为720bp,编码了一条由239个氨基酸组成的多肽,其非编码区含有3个ATTTA基序,预测的氨基酸序列中包含有一个长为51个氨基酸的前体肽和一个长为171个氨基酸的结构域,在氨基酸序列的第201-221位,存在着一个IL-1基因家族信号序列,该序列由21个氨基酸组成。大弹涂鱼IL-8基因编码区全长306 bp,编码了一条由101个氨基酸组成的多肽链,其中前18个氨基酸残基为信号肽序列(MKLCVAVMLGTLFVLANGM),分泌之后在蛋氨酸和丝氨酸之间位置切割,形成成熟肽。IL-8基因编码的肽链结构域SCY由62个氨基酸组成。2.大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因进化分析本文通过建立系统发生树,对大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因进行了进化分析,分析显示,IL-1β基因在进化过程中受到了正选择作用,在进化枝模型中发现了15个正选择位点,并通过对进化枝-位点模型的分析,推测IL-1β基因在进化过程中至少受到了三次正选择的作用,分别发生在脊椎动物早期的进化中、鸟类祖先枝中和哺乳动物的祖先分枝中。而对IL-8基因的进化分析表明,IL-8基因在进化过程中一直受到纯化选择的作用,高度保守,说明该基因在进化过程中稳定,且一直处于不可替代的地位。3.大弹涂鱼IL-1β、IL-8和IL-10基因的组织差异表达通过荧光定量分析了大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因在不同健康组织中的表达差异,研究结果表明大弹涂鱼IL-1β和IL-8基因虽然在不同组织中均有所表达,但其表达量有很大的差异。IL-1β在大弹涂鱼脾中的表达量最高,其次是鳃,而大弹涂鱼IL-8基因在脑、脾和鳃中的表达量最高,最低的是皮肤,推测不同鱼类的免疫基因在不同组织中的表达量和表达模式是不尽相同的。4.大弹涂鱼IL-1β、IL-8和IL-10基因在不同病原体感染后的表达分析通过荧光定量实验分析了大弹涂鱼IL-1β和IL-10基因在肝和脾,IL-8基因在肝、脾和脑受鳗弧菌和poly(I:C)感染后的表达模式,结果表明:(1)大弹涂鱼IL-1β基因在对病毒感染后具有更高的敏感性,不同鱼类的脾脏对病毒感染可能会发生不同的反应。(2)大弹涂鱼IL-8基因对受到病毒感染和细菌感染后肝和脾中的免疫应答过程十分重要,且脾脏的免疫应答早于肝脏。大弹涂鱼脑组织在受到细菌和病毒胁迫后可能会发生脑损伤,其IL-8的产生可能不仅来自于巨噬细胞,也可能来自于胶质细胞。(3)对于IL-10基因,分析其在鳗弧菌感染后的肝和脾脏中可能有着不同的激活途径。