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肥胖是危害人类健康的公共卫生问题,与多种慢性代谢性疾病的发生发展密切相关。深入研究肥胖的发病机制有助于为这些慢性病建立有效的防治手段。肥胖源于长期能量摄入与消耗的不平衡,并导致脂质异位沉积在脂肪组织以外的各组织中。研究表明肥胖和2型糖尿病(T2DM)都与胰岛素抵抗有关,因此了解胰岛素抵抗的发生及发展机制是肥胖和T2DM有效防治的重要前提。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在糖脂代谢中的作用越来越多地被发掘。Lnc RNA H19(H19)是最早被发现且目前研究较多的lnc RNA之一,在骨骼肌中高表达,可促进骨骼肌葡萄糖摄取,也有研究显示H19参与肝脏脂质代谢的调控,但这些研究仍存在矛盾之处,未有明确定论。另外,H19对骨骼肌的脂质代谢鲜有报道,还需要大量的研究去探索其具体作用及其机制。本研究主要通过体内和体外实验探讨H19对肥胖小鼠糖脂代谢的影响及其潜在机制。体内实验中,db/db小鼠被用作肥胖和胰岛素抵抗模型,采用尾静脉注射H19过表达腺病毒的方式构建H19过表达的db/db小鼠,观察H19对肥胖小鼠糖脂代谢的影响以及对骨骼肌脂质代谢的作用。体外实验中,本研究分离培养原代骨骼肌细胞,进行H19的过表达和敲低,而后观察H19对原代骨骼肌细胞脂质代谢和线粒体功能的影响,并探讨其可能的作用机制。第一部分过表达H19对肥胖小鼠糖脂代谢和脂质异位沉积的作用及其机制的初步探讨目的探讨长链非编码RNA H19在肥胖小鼠糖脂代谢、肝脏脂质沉积和骨骼肌脂质代谢中的作用,并对该效应的可能机制进行初步探讨。方法将8周龄db/db小鼠随机分为阴性对照组(ad-GFP组,n=6)和H19过表达组(ad-H19组n=6),ad-GFP组行尾静脉注射阴性病毒,ad-H19组注射H19过表达腺病毒。注射2周后,进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),检测空腹血清胰岛素及血糖水平、糖化血清白蛋白、血清甘油三酯等,并称取小鼠体重以评估H19对肥胖小鼠糖脂代谢的作用。检测骨骼肌甘油三酯含量,行骨骼肌组织油红O染色和苏木精-伊红(H&E)染色以评估H19对肥胖小鼠骨骼肌脂代谢的影响。利用Western blotting和q RT-PCR检测小鼠骨骼肌中下游脂质代谢相关基因蛋白和m RNA的变化。结果1.成功构建H19过表达db/db小鼠模型:ad-H19组小鼠肝脏和骨骼肌中H19是ad-GFP组的7倍和2.6倍,(p<0.05),提示H19过表达的db/db小鼠模型构建成功。2.H19过表达显著改善db/db小鼠高血糖状态:ad-H19组小鼠糖化血清白蛋白(4.2mmol/L)显著低于ad-GFP组(5.0mmol/L,(p<0.05)),OGTT结果显示,ad-H19组小鼠葡萄糖曲线下面积(2642±615mmol/L·min)明显小于ad-GFP组(3303±340mmol/L·min),提示过表达H19可显著改善db/db小鼠的高血糖状态。3.H19过表达显著改善db/db小鼠骨骼肌脂质沉积:H&E染色和油红染色显示与ad-GFP组相比,ad-H19组小鼠骨骼肌内脂质聚积减少,检测骨骼肌内和血清甘油三酯含量提示,ad-H19组小鼠骨骼肌内甘油三酯(0.10 gprot/L)和血清甘油三酯(1.8mmol/L)显著低于ad-GFP组(0.18 gprot/L和2.0 mmol/L)(p<0.05),提示H19过表达可改善db/db小鼠骨骼肌脂质沉积。4.H19过表达显著改善db/db小鼠肝脏脂质沉积:与ad-GFP组相比,ad-H19组小鼠的肝脏脂肪浸润症状减轻,肝脏总胆固醇和甘油三酯含量降低;小鼠血清总胆固醇、肝重/体重比及血清ALT和AST水平无明显变化,提示H19过表达可改善db/db小鼠肝脏脂质沉积。5.H19过表达上调db/db小鼠骨骼肌中脂肪酸代谢基因的表达:ad-H19组小鼠骨骼肌中脂肪酸代谢相关基因(Pgc1α、Cpt1b及Cd36)的m RNA水平分别是ad-GFP组的2.2、1.6和2.5倍(p<0.05),相应的蛋白水平分别是ad-GFP组的1.9、1.8和1.9倍(p<0.05),提示H19过表达上调骨骼肌中脂肪酸代谢基因的表达。结论过表达H19改善db/db小鼠的高血糖状态,降低血清甘油三酯,减少肝脏和骨骼肌中脂质异位沉积。上述效应的机制可能与H19过表达增加了db/db小鼠骨骼肌的脂肪酸代谢有关。H19调控原代骨骼肌细胞脂质代谢和线粒体功能的研究目的我们在第一部分研究中发现过表达H19改善db/db小鼠的高血糖状态,降低血清甘油三酯水平,减少肝脏和骨骼肌中脂质异位沉积,且增加骨骼肌中脂肪酸代谢相关基因(Pgc1α、Cpt1b及Cd36)的表达水平。因此我们假设H19缓解肥胖小鼠脂质沉积主要是通过增强骨骼肌的脂肪酸代谢。为了进一步验证我们的假设,本部分研究在原代骨骼肌细胞中过表达H19和敲低H19,观察H19对原代骨骼肌细胞脂肪酸代谢和线粒体功能的影响。方法对野生型小鼠和H19敲除小鼠的骨骼肌样本进行生物信息学分析,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行功能富集。从C57BL/6J乳小鼠中分离培养原代肌卫星细胞并用2%马血清培养基诱导为成熟的原代骨骼肌细胞。利用H19过表达腺病毒和si RNA分别对原代骨骼肌细胞进行H19过表达和敲低,用游离脂肪酸构建脂质沉积的原代骨骼肌细胞模型。后续尼罗红染色和检测细胞内甘油三酯和甘油二酯含量评估H19对原代骨骼肌细胞脂质代谢作用,利用海马实验检测有氧呼吸速率(OCR)、透射电镜观察线粒体形态、行线粒体染色和检测线粒体DNA拷贝数检测线粒体数量来评估H19对原代骨骼肌细胞线粒体功能的影响。Western blotting和q RT-PCR检测线粒体电子传递链复合物和脂肪酸代谢相关基因表达情况。结果1.H19可调控骨骼肌的线粒体代谢:利用野生型小鼠和H19敲除小鼠的骨骼肌组织鉴定出554个差异表达基因,富集分析发现这些差异基因主要富集在线粒体代谢相关的通路上。2.成功构建H19过表达和H19敲低的原代骨骼肌细胞:成功分离培养出纯的原代肌卫星细胞并诱导为成熟的原代骨骼肌细胞。利用H19过表达腺病毒感染原代骨骼肌细胞过表达H19和si RNA转染原代骨骼肌细胞敲低H19表达,结果提示,病毒处理组细胞H19表达是对照组细胞的2.7倍(p<0.01);利用si RNA转染原代骨骼肌细胞,结果提示与对照组细胞相比,si RNA处理组细胞H19表达减少60%(p<0.001),提示H19过表达和H19敲低的原代骨骼肌细胞构建成功。3.H19过表达减少原代骨骼肌细胞脂质聚积,敲低则增加脂质聚积:在过表达H19的原代骨骼肌细胞中,由游离脂肪酸诱导的甘油三酯和甘油二酯含量明显减少(p<0.05);在敲低H19的原代骨骼肌细胞中,甘油三酯和甘油二酯含量进一步增加(p<0.05)。4.H19过表达增加原代骨骼肌细胞的线粒体呼吸,敲低则抑制线粒体呼吸:在过表达H19的原代骨骼肌细胞中,基础呼吸率、最大呼吸率和ATP产生增加(p<0.05),且由游离脂肪酸导致的线粒体肿胀、嵴断裂、空泡变性得到明显改善;在敲低H19的原代骨骼肌细胞中,基础呼吸率、最大呼吸率和ATP产生减少(p<0.05)。检测原代骨骼肌细胞的线粒体拷贝数,结果提示过表达H19和敲低H19不改变线粒体的数量。5.H19过表达增加原代骨骼肌细胞脂肪酸代谢基因的表达,敲低则减少该表达:原代骨骼肌细胞中过表达H19增加线粒体电子传递链复合物(ATP5A和MTCO1)的蛋白水平(p<0.01)和脂肪酸代谢相关基因(Pgc1α、Cd36、Cpt1b、Pdk4和Sirt1)的m RNA水平(p<0.05);原代骨骼肌细胞中敲低H19减少脂肪酸代谢相关基因(Pgc1α、Cd36、Cpt1b、Pdk4和Sirt1)的m RNA水平(p<0.05)。结论特异性敲除H19可调控小鼠骨骼肌中554个基因的表达,且这些基因的生物学功能与线粒体代谢相关。过表达H19可改善由FFA诱导的原代骨骼肌细胞内脂质聚积,增强线粒体呼吸,改善线粒体形态;敲低H19则增加原代骨骼肌细胞中脂质含量,减弱线粒体呼吸。这些效应主要是通过调控线粒体和脂肪酸代谢相关基因的表达而产生,提示H19可调控原代骨骼肌细胞的脂质代谢和线粒体功能。第三部分H19调控原代骨骼肌细胞脂质代谢和线粒体功能的分子机制研究目的在第二部分我们揭示了H19对原代骨骼肌细胞脂质代谢和线粒体功能的重要调控作用,但其具体作用机制仍不清楚。Lnc RNA常常可通过与RNA结合蛋白(RBP)的相互作用影响下游靶基因的表达变化从而引起功能学上的改变。因此我们假设H19可与某个RBP相互结合作用于下游线粒体和脂肪酸代谢相关基因来发挥作用。本部分研究的目的是寻找与H19直接结合的RBP、验证该RBP的生物学功能以及H19与该RBP之间的相互调控作用。方法采用RNA蛋白下拉实验结合质谱分析寻找与H19直接结合的RBP,用Western blotting和RNA免疫共沉淀实验进一步验证两者的结合。用靶向该RBP的si RNA敲低其在原代骨骼肌细胞中的表达,后续检测肌细胞内的甘油三酯和甘油二酯含量,利用海马实验检测该RBP对原代骨骼肌细胞线粒体呼吸的影响,Western blotting检测其对线粒体和脂肪酸代谢相关基因的表达变化。再利用过表达该RBP的质粒在敲低H19的原代骨骼肌细胞中过表达该RBP,后续检测线粒体呼吸和脂肪酸代谢相关基因以明确H19与RBP之间的相互调控作用。结果1.H19可与hn RNPA1直接结合:通过RNA蛋白下拉实验结合质谱分析确定hn RNPA1与H19可相互结合,并利用Western blotting和RNA免疫共沉淀进一步验证了两者的结合。2.Hn RNPA1可结合脂肪酸代谢基因:hn RNPA1抗体可结合脂肪酸代谢基因Cpt1b、Pgc1α和Cd36的m RNA形式。3.敲低hn RNPA1增加原代骨骼肌细胞脂质聚积,抑制其线粒体呼吸,减少脂肪酸代谢基因的表达:利用si RNA成功在原代骨骼肌细胞中敲低hn RNPA1(p<0.05),敲低hn RNPA1增加原代骨骼肌细胞中甘油三酯和甘油二酯含量(p<0.05),抑制线粒体最大呼吸率和ATP产生(p<0.05),减少脂肪酸代谢相关基因(CPT1b、SIRT1及PGC1α)的蛋白水平和AMPK的磷酸化水平(p<0.05)。4.过表达hn RNPA1可部分回复H19敲低引起的作用:过表达hn RNPA1可部分回复敲低H19对原代骨骼肌细胞的线粒体呼吸抑制作用,并增加CPT1b和PGC1α的蛋白水平。结论H19与hn RNPA1蛋白可直接结合。敲低hn RNPA1增加原代骨骼肌细胞内脂质聚积和抑制线粒体功能。过表达hn RNPA1可部分回复敲低H19造成的线粒体呼吸抑制及CPT1b和PGC1α的蛋白水平降低,提示H19与hn RNPA1两者可相互作用并共同调控原代骨骼肌细胞的脂质代谢和线粒体功能,其机制可能为H19招募hn RNPA1调控下游CPT1b和PGC1α的表达水平。