【摘 要】
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研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是主要起源于肝脏上皮细胞的恶性肿瘤,居世界肿瘤发病率和死亡率的第五和第二位,是我国第四位常见的恶性肿瘤。目前,已经确定的肝癌危险因素包括乙型（Hepatitis B virus,HBV）和丙型（Hepatitis C virus,HCV）肝炎病毒的慢性感染,以及饮食中黄曲霉毒素（Aflatoxin）暴露是肝癌的主要病因之
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（编号:81872228,81430059,81472559和81772490）； 国家重点研发项目（编号:2016YF0902000和2020YFC20027050）； 中国医学科学院创新基金（编号:2016-I2M-1-001 and 2019-I2M-1-003）；
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研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是主要起源于肝脏上皮细胞的恶性肿瘤,居世界肿瘤发病率和死亡率的第五和第二位,是我国第四位常见的恶性肿瘤。目前,已经确定的肝癌危险因素包括乙型（Hepatitis B virus,HBV）和丙型（Hepatitis C virus,HCV）肝炎病毒的慢性感染,以及饮食中黄曲霉毒素（Aflatoxin）暴露是肝癌的主要病因之一。黄曲霉毒素相关肝癌是我国肝癌患者区别于国外发病患者的一个显著类型,黄曲霉毒素被人体摄取后,进入肝细胞引起细胞发生恶性转化继而诱发肝癌的进程和结局各有不同,因此探寻肝细胞内与黄曲霉毒素代谢和毒性相关的关键分子,寻找黄曲霉毒素的潜在受体,阐述影响黄曲霉毒素代谢的调控机制并发现筛查黄曲霉肝癌易感靶点迫在眉睫。研究目的:（1）明确肝癌细胞内黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的结合分子,揭示AFB1进入肝癌细胞后的关键步骤;（2）明确AFB1对下游代谢通路的调控作用,进一步阐明AFB1诱导肝癌发生的分子机制;（3）预测AFB1与关键抗性分子的作用机制;（4）明确黄曲霉相关肝癌（AF-HCC）免疫治疗靶点的可行性。研究方法:本研究基于全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选技术,将AFB1作用于肝癌细胞系PLC/PRF/5,经过6轮AFB1的诱导后,收集存活的肝癌细胞,通过二代测序鉴定出能够抵抗AFB1持续诱导的关键基因。利用非靶向代谢组学检测AFB1对AHR敲降前后肝癌细胞代谢物质的丰度变化。通过大肠杆菌体系纯化出AHR蛋白分子的N端和C端蛋白,利用核磁饱和转移差谱技术（STD）确定AFB1与AHR蛋白的结合能力。通过分子对接预测AFB1与AHR的结合位点,检测关键结合位点的AHR突变体蛋白与AFB1的结合力。收集江苏启东地区黄曲霉相关肝癌患者标本,检测AHR表达水平与PD-L1表达的关系。体内实验验证PD-L1抑制剂对AHR高表达肝癌的治疗效果。研究结果:全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选发现AHR敲降的肝癌细胞系可以耐受高浓度的AFB1。AFB1可以增加肝癌坏死过程中长链脂肪酸的积累,且AHR是调控长链脂肪酸代谢的关键因子。AFB1可以激活AHR的表达,并且促进AHR蛋白入核过程,与ARNT形成二聚体,调控下游P450代谢通路相关基因的表达。AHR蛋白的N端可以与AFB1直接结合,第208位的异亮氨酸是调控两者结合能力的关系位点。AHR的缺失可以显著降低肝癌细胞内黄曲霉加合物的形成,减少AFB1对肝细胞的损伤,且AHR的高表达会促进肝癌细胞PD-L1表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。结论:本课题通过全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选和多种分子生物学实验阐明了 AHR是AFB1潜在的胞内代谢性穿梭受体,其在AFB1代谢和毒素诱导的肝癌中起重要作用,可以作为黄曲霉相关肝癌的候选治疗靶标。AHR的激活可以诱导PD-L1的表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。研究背景:爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）与多种恶性肿瘤有关,EBV的持续感染会导致多种恶性肿瘤,包括伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,胃癌等。EBV病毒致癌蛋白的表达和慢性炎症的发生是导致肿瘤发生发展的主要机制,但是目前针对EBV整合到人类基因组中破坏基因表达或基因组稳定性的系统系研究仍然较少。研究目的:我们的工作为多种恶性肿瘤的EBV整合图谱提供了大规模的全基因组分析。我们比较了不同肿瘤中EBV整合位点之间的差异,并且探讨了 EBV整合对基因表达的影响,试图阐明EBV整合与肿瘤发生和发展之间的联系。研究方法:我们收集了多个肿瘤的冷冻组织标本,包括NPC（n=177;中山大学肿瘤防治中心和广西医科大学附属第一医院）;胃癌（n=39;中山大学肿瘤防治中心和青岛大学附属医院）;NK/T细胞淋巴瘤（n=25;中山大学癌症中心和瑞金医院）;霍奇金淋巴瘤（n=11;中山大学癌症中心）;鼻咽炎（n=1;中山大学癌症中心）。从这些肿瘤组织中分离基因组DNA,使用靶向EBV的单链DNA探针对基因组DNA进行杂交捕获,并使用生物信息学方法分析全基因组范围内EBV整合位点特征和整合数量差异。同时,我们检测了 EBV常见整合位点附近的基因表达变化,并通过免疫组织化学验证了热点基因与EBV之间的关系。研究结果:我们从33个肿瘤和C666-1细胞系中共鉴定出197个EBV整合位点,其中EBV在胃癌的整合率（25.6%）高于鼻咽癌的整合率（9.6%）。我们发现多个EBV整合位点位于调节TNF-α,NF-κB信号通路的肿瘤抑制基因和炎症相关基因的附近。此外,在EBV基因组中,这些断点经常位于oriP或末端重复序列。这些断点常被微同源序列包围,这与涉及病毒基因组复制和微同源介导的重组的整合机制一致。结论:EBV整合优先发生在宿主基因组染色体不稳定的区域内,整合位点常位于EBV基因组的oriP或末端重复序列周围。多个EBV整合位点位于肿瘤抑制基因的附近,这些基因在癌症进展过程中经常被破坏。EBV整合参与了 EBV复制和微同源性介导的基因重组。
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