第一部分：不同月龄APP转基因小鼠学习记忆能力及突触的改变以及淫羊藿有效成分的干预作用 目的：阿尔茨海默病(AD)是一种进行性中枢神经系统变性疾病。为进一步探讨AD的病理机制及阐明中药淫羊藿有效部位淫羊藿黄酮及有效成分淫羊藿苷防治AD的药理作用及机制，我们观察了拟AD动物模型-APP转基因模型小鼠学习记忆能力和突触结构及其相关蛋白随增龄的变化及淫羊藿黄酮和淫羊藿苷对10月龄APP转基因小鼠这一典型拟AD动物模型的干预作用。 方法：同月龄同背景C57BL/6J小鼠为正常对照组，同月龄同背景APP转基因阴性小鼠作为转基因阴性对照组，4月龄APP695V717I转基因小鼠分为模型组和用药组，持续饲养6个月至10月龄；其中，用药组分为淫羊藿黄酮小、大剂量组及淫羊藿苷小、大剂量组；自4月龄始灌胃给药至10月龄。应用Morris水迷宫和物体识别试验对各组小鼠进行行为学测试。免疫组化法及免疫印迹法分别检测海马和皮层突触素、突触后致密物质-95(PSD-95)的表达。透射电镜观察海马神经毡突起内线粒体、细胞骨架蛋白、突触数目及突触内囊泡超微结构变化。图像分析采用Image-pro Plus 5.0和Image-J 7.0分析软件。实验结果采用Mean±SE表示，全部统计分析采用SPSS 11.5软件，分别使用适合的统计学方法分析。 结果： (一)APP转基因模型小鼠的增龄变化： 4月龄APP转基因小鼠在Morris水迷宫实验中的潜伏期明显延长；海马CA1区神经元突起内超微结构和突触结构基本正常，但突起内线粒体结构轻度肿胀并伴有部分内嵴和外膜断裂，突触连接减少，突触数密度有降低趋势，突触囊泡明显减少；海马和皮层的突触素和突触后致密物质-95(PSD-95)表达有降低趋势。10月龄APP转基因小鼠在Morris水迷宫实验中潜伏期和游泳距离均明显延长；物体识别实验中分辨指数也明显下降；海马CA1区突起内线粒体肿胀、嵴断裂甚至空泡化，突触数量减少，突触前后膜及突触间隙结构模糊不清，突触后致密物质变薄，神经毡内多数突触小泡减少甚至消失；皮层和海马CA1区、CA3区及齿状回的突触素表达明显降低，皮层和海马PSD-95蛋白表达明显减少。 (二)淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对模型小鼠病理改变的干预作用： 淫羊藿黄酮及淫羊藿苷灌胃给药6个月可明显缩短10月龄APP转基因小鼠Morris水迷宫的潜伏期和游泳距离；提高其在物体识别实验中的分辨指数。减轻模型小鼠神经元突触损伤，使模型小鼠海马CA1区神经毡突起内线粒体轮廓清晰，嵴多而明显，突触连接丰富，结构基本正常，突触前后膜及突触间隙结构清晰，突触后致密物增厚，囊泡数量增加；增加APP转基因模型小鼠皮层及海马突触素和PSD-95蛋白的表达。 结论：APP转基因模型小鼠随增龄出现多种类似AD的病理改变，包括10月龄转基因小鼠学习记忆能力下降，神经元突触结构损伤，突触相关蛋白表达减少。证明APP转基因模型小鼠能够较好地模拟AD的病程进展，可广泛用于AD发病机理和防治AD药物作用机制的研究。淫羊藿黄酮及淫羊藿苷在本部分实验中防治老年痴呆的药理机制涉及上述各个环节，可通过促进突触相关蛋白表达而发挥维护神经元突触正常结构的作用，进而从宏观上改善AD的学习记忆能力，提示淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对防治AD具有良好的应用前景。 第二部分：不同月龄APP转基因小鼠脑内β-淀粉样肽(A β)生成的改变及淫羊藿有效成分的干预作用 目的：本实验的目的是进一步探讨APP转基因模型小鼠在模拟AD病理进程中A B生成和聚集随增龄改变及其与突触损伤相互关系的内在规律，并进一步观察淫羊藿黄酮和淫羊藿苷对APP转基因小鼠脑内A β过度生成过程中各个环节的影响。 方法：动物的分组及给药同第一部分实验。分别采用免疫组化法及免疫印迹法检测海马和皮层APP、β-位点剪切酶(BACE)及早老素-1(PS-1)的表达，双抗体夹心ELISA方法检测海马不溶性A β<,1-42>含量，刚果红和Bielschowsky银染色法检测淀粉样斑块数量，免疫荧光双标法检测皮层及海马神经元A β与淀粉样纤维的共定位。图像分析采用Image-pro Plus 5.0和Image-J 7.0分析软件。实验结果采用Mean±SE表示，全部统计分析采用SPSS 11.5软件，分别使用适合的统计学方法分析。 结果： (一)APP转基因模型小鼠的增龄变化： 4月龄转基因小鼠皮层及海马中APP、BACE、PS-1表达及海马不溶性A β含量仅有轻微增加；海马分子层及顶叶皮层中未有淀粉样斑块出现。免疫荧光结果显示4月龄模型小鼠脑内脑内几乎没有A β1-42表达及硫代黄素T阳性染色，提示Aβ1-42产生较少，还不足以聚集成淀粉样纤维。10月龄转基因小鼠皮层及海马中APP、BACE、PS-1表达及海马不溶性Aβ含量明显增加；海马分子层和顶叶皮层中淀粉样斑块数量明显增加；免疫荧光双标结果显示，10月龄APP转基因模型小鼠脑内出现明显的A β1-42与硫代黄素T阳性染色共表达，且出现二者共同定位的包涵体样结构，说明10月龄APP转基因模型小鼠大脑神经元突起中已有A β1-42大量表达。提示A β过表达和聚集与淀粉样斑块形成密切相关。 (二)淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对模型小鼠病理改变的干预作用： 淫羊藿黄酮及淫羊藿苷能使10月龄APP转基因小鼠皮层及海马中APP蛋白表达降低；BACE和PS-1蛋白表达减少；海马中不溶性A β1-42含量降低；海马分子层和顶叶皮层中淀粉样斑块数量减少。免疫荧光双标实验结果显示，与10月龄APP转基因模型组小鼠相比，淫羊藿黄酮和淫羊藿苷组小鼠大脑神经元的胞浆和突起内，A β1-42表达均不同程度地下降，包涵体数量也有所减少，提示淫羊藿黄酮和淫羊藿苷可通过减少模型小鼠脑内A β含量，从而减少淀粉样斑块的形成。 结论：APP转基因模型小鼠较好地模拟了AD脑内A β级联假说有关的病理改变，可用作研究AD发病机理和防治AD药物作用机制的研究。淫羊藿黄酮及淫羊藿苷可通过减少APP转基因模型小鼠脑内APP蛋白及BACE和PS-1表达来抑制A β经由淀粉源性途径的生成，从而减少淀粉样斑块的数量。以上结果证明淫羊藿黄酮及淫羊藿苷可在APP转基因模型小鼠病理进程中的多个环节上发挥其抗AD的药理作用，说明淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对防治AD具有潜在应用价值。 第三部分：不同月龄APP转基因小鼠脑内α-Synuclein及相关蛋白的改变及淫羊藿有效成分的干预作用 目的：本实验目的是进一步探讨APP转基因小鼠脑内α-syn表达随增龄的变化规律及其与A β的相互影响，并观察淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对上述环节的干预作用。 方法：动物的分组及给药同第一部分实验。采用免疫组化法及免疫印迹法检测海马和皮层α-syn及HSP70蛋白的表达，免疫组化法检测海马Ub、parkin及UCH-L1蛋白的表达，免疫荧光双标方法检测脑神经元内α-syn分别与A β、Ub及淀粉样纤维共同定位的情况，同时检测了parkin分别与α-syn及Ub的共同定位。图像分析采用Image-pro Plus 5.0和Image-J 7.0分析软件。实验结果采用Mean±SE表示，全部统计分析采用SPSS 11.5软件，分别使用适合的统计学方法分析。 结果： (一)APP转基因模型小鼠的增龄变化： 4月龄转基因小鼠大脑海马与皮层α-syn、热休克蛋白70(HSP70)表达及海马中泛素、parkin表达明显增加；海马中泛素化蛋白羧基端水解酶表达明显降低。10月龄转基因小鼠大脑海马与皮层中α-syn、海马中泛素表达明显增加；海马中parkin、泛素化蛋白羧基端水解酶及海马与皮层中热休克蛋白HSP70表达明显降低；免疫荧光双标结果显示，10月龄转基因小鼠海马与皮层顶叶神经元内α-syn、泛素分别与淀粉样纤维存在共同定位； parkin分别与α-syn及泛素存在共同定位，提示α-syn可能经由泛素介导的泛素-蛋白酶体途径降解，并发生聚集，参与淀粉样斑块形成。从4月龄增至10月龄，APP转基因小鼠海马与皮层中α-syn以及海马中泛素表达呈持续增加趋势；海马中泛素化蛋白羧基端水解酶(UCH-L1)表达呈持续减少趋势；海马中parkin以及海马与皮层的热休克蛋白HSP70表达随增龄出现先升后降的趋势。 (二)淫羊藿黄酮及淫羊藿苷对模型小鼠病理改变的干预作用： 淫羊藿黄酮及淫羊藿苷能够降低10月龄APP转基因小鼠海马与皮层中α-syn表达；增加海马中泛素、parkin和泛素化蛋白羧基端水解酶(UCH-L1)以及海马与皮层中热休克蛋白HSP70表达。提示淫羊藿黄酮及淫羊藿苷可能通过改善UPP系统对α-syn的降解功能来减少α-syn的过表达及异常聚集。 结论： APP转基因模型小鼠较好地模拟了AD病人脑内SP核心成分的α-syn蛋白相关的一系列病变，为更全面了解AD及其它神经退行性疾病的发病机制提供了较好的实验动物研究基础。淫羊藿黄酮和淫羊藿苷能通过直接抑制α-syn过表达和聚集以及间接通过增加热休克蛋白HSP70及UPP通路中泛素、parkin、UCH-Ll等诸多蛋白表达来改善UPP降解α-syn的功能以达到保护神经元及突触的正常结构和功能，并最终改善学习记忆能力。说明淫羊藿黄酮和淫羊藿苷不但可用于AD防治，还可能对其它神经退行性疾病的防治具有潜在应用价值。