【摘 要】
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目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是引起终末期肾脏病的主要病因之一,也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。蛋白质硝基化修饰是DN发病机制的重要环节。硝基化修饰可以引起蛋白质分子理化性质的变化、生物学功能的受损。但国内外既往研究局限于以硝基化酪氨酸作为标志物来反映机体的硝基化程度,针对硝基化蛋白质的功能研究鲜有报道。检测高糖作用下,肾脏发生硝基化修饰的蛋白并进一步开展功
【基金项目】
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国家自然科学基金（基金编号81700637）；
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目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是引起终末期肾脏病的主要病因之一,也是糖尿病患者致残、致死的主要原因。蛋白质硝基化修饰是DN发病机制的重要环节。硝基化修饰可以引起蛋白质分子理化性质的变化、生物学功能的受损。但国内外既往研究局限于以硝基化酪氨酸作为标志物来反映机体的硝基化程度,针对硝基化蛋白质的功能研究鲜有报道。检测高糖作用下,肾脏发生硝基化修饰的蛋白并进一步开展功能研究将对阐明DN发病机制有重要意义。本课题组既往在DN小鼠的研究中发现3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）酪氨酸硝基化修饰参与了DN的发生发展,但其具体修饰位点及作用方式尚不清楚。进一步明确GAPDH酪氨酸硝基化修饰位点,并阐明硝基化修饰对GAPDH蛋白功能影响的可能机制,将为发现GAPDH在DN发病机制中扮演的角色及探求新的治疗靶点提供理论和实验依据。方法:1.予以过氧亚硝酸盐处理HK-2细胞,应用串联质谱鉴定HK-2细胞中发生酪氨酸硝基化修饰的蛋白。2.GAPDH质粒转化、扩增、提取,待HK-2细胞融合至80%时,将GAPDH质粒（已去内毒素处理）转染HK-2细胞,Western blot和RT-PCR检测GAPDH过表达情况。质粒转染细胞48h后,予以过氧亚硝酸盐刺激,应用串联质谱鉴定GAPDH酪氨酸硝基化位点。3.根据质谱鉴定结果构建GAPDH的酪氨酸硝基化位点突变质粒,转染至HK-2细胞。4.MOE软件模拟预测GAPDH与NAD+的相关性。5.将细胞分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、高糖及GAPDH-Y314A突变质粒转染组（HG+GAPDH-Y314A）,检测NAD+含量。6.Western blot检测自噬相关指标LC3II/I、P62的蛋白表达情况,RT-PCR检测SIRT1的m RNA表达情况。结果:1.肾小管上皮细胞酪氨酸硝基化修饰蛋白鉴定结果:1.1获得HK-2细胞中113种蛋白发生了酪氨酸硝基化修饰,成功检测到其发生硝基化的氨基酸序列及酪氨酸硝基化位点,鉴定出的硝基化蛋白分别参与脂质代谢、氧化应激及信号传导等功能活动。1.2部分DN相关硝基化蛋白位点鉴定结果:半乳糖基转移酶（Beta-1,4-galactosyltransferase 4,GALT）的酪氨酸硝基化位点位于Tyr158,尿苷二磷酸-葡萄糖-脱氢酶（UDP-glucose dehydrogenase,UGDH）的酪氨酸硝基化位点位于Tyr53。2.GAPDH酪氨酸硝基化位点的鉴定结果:2.1 GPS-YNO2 1.0软件预测出GAPDH的Tyr314位点易发生硝基化修饰。2.2应用串联质谱成功鉴定出HK-2细胞中GAPDH的酪氨酸硝基化位点位于Tyr314。3.GAPDH硝基化修饰对HK-2细胞NAD+的影响:3.1 MOE软件预测GAPDH与NAD+可以发生结合,两者存在相关性。3.2与NG组相比,HG组中的NAD+含量显著升高,HG+GAPDH-Y314A组中NAD+含量显著降低。4.GAPDH硝基化修饰对HK-2细胞SIRT1表达及自噬的影响:4.1SIRT1 m RNA表达水平检测结果显示,与NG组相比,HG组SIRT1表达显著降低;与HG组比较,HG+GAPDH-Y314A组SIRT1表达显著升高。4.2自噬相关蛋白LC3II/I检测结果显示,与NG组相比,HG组LC3II/I表达显著降低;与HG组相比,HG+GAPDH-Y314A组LC3II/I表达显著升高。4.3自噬相关蛋白P62检测结果显示,与NG组相比,HG组P62表达显著升高;与HG组相比,HG+GAPDH-Y314A组P62表达显著升高。结论:1.成功鉴定出肾小管上皮细胞中113种硝基化修饰蛋白及酪氨酸硝基化修饰位点。2.成功鉴定出肾小管上皮细胞中GAPDH酪氨酸硝基化修饰位点位于Tyr314。3.高糖状态下,GAPDH的Tyr314酪氨酸位点硝基化修饰后,使GAPDH与辅酶NAD+结合受限,抑制其活化SIRT1功能,进而抑制SIRT1介导的肾小管上皮细胞自噬。
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