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紧密连接（Tight Junctions,TJs）位于细胞的侧面顶端,发挥“门”和“栅栏”功能。当其结构和功能的完整性遭到破坏时,会引起肿瘤发生转移。紧密连接蛋白（claudins,CLDNs）作为组成TJs的重要成分,其表达异常会破坏TJs的完整性,导致细胞极性消失,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力增强。CLDN6作为CLDNs家族成员之一,其结构也是由一个羧基末端、一个氨基末端、四个跨膜区域和两个细胞外环共同组成的。其羧基末端富含多个酪氨酸磷酸化位点,可被酪氨酸激酶磷酸化。研究发现,CLDN6与Src家族酪氨酸激酶（Src family kinases,SFKs）相互作用,招募SFKs到Y196和Y200位点上,并使Y196/Y200位点发生磷酸化,SFKs-SH2与CLDN6上磷酸化的Y196/Y200的结合加强,从而完全激活SFKs,进而激活其下游信号通路。Src是SFKs家族的核心成员,可作为膜受体与细胞质信号机制之间建立联系,从而调节各种基本的细胞过程。Src包含多个结构域,其中催化结构域SH1包含酪氨酸磷酸化位点Y419,使Src发生自磷酸化,活化的Src可以激活信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）信号通路。STAT3参与多种肿瘤的增殖分化、免疫逃避、血管新生及侵袭等生物调控过程。STAT3一方面为活化的受体和非受体酪氨酸激酶传递信号,另一方面发挥转录因子的作用。活化的STAT3形成同源二聚体或异源二聚体,从细胞质直接进入到细胞核,与基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）基因的启动子区结合促进其表达,进而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。目前,关于CLDN6与Src相互作用,激活Src/STAT3信号通路的研究还未见报道。目的:探讨CLDN6通过激活Src/STAT3信号通路影响肝癌细胞迁移和侵袭的作用机制,为CLDN6作为肝癌潜在治疗靶点的研究提供实验依据。方法:1.CLDN6和Src在人肝癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系1.1 CLDN6和Src在人肝癌组织中的表达及其相关性TCGA数据库分析人肝癌组织中CLDN6和Src的表达并分析两者之间的相关性。1.2人肝癌组织中CLDN6和Src的表达与临床病理学参数的关系免疫组织化学染色分析CLDN6和Src在人肝癌组织中的表达,并分析其与肝癌患者临床病理参数之间的关系。Spearman分析CLDN6与Src两者的相关性。1.3 CLDN6和Src在人肝癌细胞中的定位免疫荧光染色实验检测Hep G2细胞中CLDN6和Src的定位。2.CLDN6对人肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响建立稳定沉默CLDN6的人肝癌细胞系（Hep G2-sh CLDN6）,RT-PCR和Western blot实验鉴定CLDN6的沉默效率。通过划痕实验,Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测沉默CLDN6对Hep G2细胞迁移和侵袭能力的影响。3.CLDN6影响人肝癌细胞迁移和侵袭的作用机制Western blot实验检测Hep G2-sh CLDN6细胞中p-Src、Src、p-STAT3、STAT3、MMP2和MMP9的蛋白表达。使用Src激动剂处理Hep G2-sh CLDN6细胞,确定Src激动剂处理Hep G2-sh CLDN6细胞的最佳作用浓度和时间。通过划痕实验,Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测Src激动剂处理后对Hep G2-sh CLDN6细胞迁移和侵袭能力的影响;Western blot实验检测Src激动剂处理后,Hep G2-sh CLDN6细胞中p-STAT3、STAT3、MMP2和MMP9的蛋白表达水平。结果:1.CLDN6和Src在人肝癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系1.1 CLDN6和Src在人肝癌组织中的表达及其相关性利用TCGA数据库中肝癌患者数据进行分析,选取369例人肝癌组织和160例癌旁组织进行分析。结果显示,与癌旁组织相比,CLDN6和Src在人肝癌组织中均高表达（P＜0.05）,两者之间呈正相关（P=0.0048＜0.01,R=0.12＞0）。1.2人肝癌组织中CLDN6和Src的表达与临床病理学参数的关系免疫组织化学染色实验结果显示,CLDN6和Src在人肝癌组织中高表达,其中CLDN6的高表达率为53.33%,Src的高表达率为86.67%。并且二者主要在细胞质中表达。CLDN6的高表达与肿瘤分化程度有关（P=0.016＜0.05）,与患者的年龄、性别、淋巴结转移以及临床分期无关。而Src的高表达与肿瘤的淋巴结转移有关（P=0.045＜0.05）,与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度和临床分期无关。Spearman分析结果显示,在人肝癌组织中,CLDN6与Src表达呈正相关（P=0.0467＜0.05,r=0.346＞0）。1.3 CLDN6和Src在人肝癌细胞中的定位免疫荧光染色结果显示,CLDN6与Src在Hep G2细胞中共定位于核膜附近的细胞质区域。2.CLDN6对人肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响成功构建稳定沉默CLDN6的人肝癌细胞株（Hep G2-sh CLDN6）。划痕实验结果显示,与空载组相比,Hep G2-sh CLDN6细胞的迁移能力明显下降,48h最为明显,差异具有显著性（P=0.0215＜0.05）。Transwell迁移实验结果显示,与空载组相比,Hep G2-sh CLDN6细胞的迁移率明显下降,差异具有显著性（P＜0.0001）。Transwell侵袭实验结果显示,与空载组相比,Hep G2-sh CLDN6细胞的侵袭能力明显减弱,差异具有显著性（P=0.0002＜0.001）。3.CLDN6影响人肝癌细胞迁移和侵袭的作用机制Western blot实验结果观察到,与空载组相比,Hep G2-sh CLDN6细胞中Src的磷酸化水平明显下降(Pp-Src/Src=0.0272＜0.05)。此外,Src下游的STAT3的磷酸化水平也明显下降(Pp-STAT3/STAT3=0.0402＜0.05)、MMP2和MMP9的表达水平同样明显下降,差异具有显著性(PMMP2=0.0348＜0.05,PMMP9=0.0465＜0.05)。Src激动剂作用于人肝癌细胞的最佳作用浓度为4 n M（P=0.0316＜0.05）,最佳作用时间为8 h（P=0.0046＜0.01）。Src激动剂作用于Hep G2-sh CLDN6细胞后,划痕实验结果显示,与未加药组相比,Src激动剂组Hep G2-sh CLDN6细胞的迁移能力明显增强,48h最为明显,差异具有显著性（P=0.013＜0.05）。Transwell迁移实验结果显示,与未加药组相比,Src激动剂组Hep G2-sh CLDN6细胞的迁移率明显增加,差异具有显著性（P=0.0164＜0.05）。Transwell侵袭实验结果显示,与未加药组相比,Src激动剂组Hep G2-sh CLDN6细胞的侵袭能力明显增强,差异具有显著性（P=0.0387＜0.05）。Src激动剂作用于Hep G2-sh CLDN6细胞后,Western blot结果显示,与未加药组相比,Src激动剂作用于Hep G2-sh CLDN6细胞后,p-STAT3与STAT3的比值显著增加(Pp-STAT3/STAT3=0.0356＜0.05),MMP2和MMP9的表达亦显著上调(PMMP2=0.0231＜0.05,PMMP9=0.000964＜0.001)。结论:1.CLDN6和Src在人肝癌组织中高表达,CLDN6表达与肿瘤分化程度有关,Src表达与肿瘤淋巴结转移有关,两者呈正相关。2.CLDN6和Src共定位于人肝癌细胞核膜附近的胞质区域。3.CLDN6通过激活Src/STAT3信号通路促进人肝癌细胞的迁移和侵袭。