【摘 要】
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微囊藻毒素（Microcystin,MC）是淡水蓝藻产生的有毒次生代谢产物。目前已有279种微囊藻毒素被发现报道,MC-LR因毒性最强、危害最大而被广泛研究。本文利用实验室已筛选的抗MC-LR单抗为靶标分子,在驼源纳米抗体库中淘筛出一株α型MC-LR的抗独特型噬菌体纳米抗体,建立基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的新型ELISA检测方法,提高了检测灵敏度并节省了单抗用量。研究内容及结果如下:（1）微囊
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微囊藻毒素（Microcystin,MC）是淡水蓝藻产生的有毒次生代谢产物。目前已有279种微囊藻毒素被发现报道,MC-LR因毒性最强、危害最大而被广泛研究。本文利用实验室已筛选的抗MC-LR单抗为靶标分子,在驼源纳米抗体库中淘筛出一株α型MC-LR的抗独特型噬菌体纳米抗体,建立基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的新型ELISA检测方法,提高了检测灵敏度并节省了单抗用量。研究内容及结果如下:（1）微囊藻毒素LR单克隆抗体的制备及鉴定。将本实验室冻存的抗MC-LR杂交瘤细胞复苏培养,大量制备腹水,经Protein G HP柱亲和纯化,通过SDS-PAGE法鉴定单抗纯化效果。对纯化的单抗进行性能测定发现,抗体效价为1:2560000,MC-LR-BSA的最佳工作浓度为2μg/mL,纯化MC-LR单抗最佳工作浓度为6.25 ng/mL。在最佳工作浓度下,建立了MC-LR间接竞争免疫分析方法,测定的MC-LR的抑制中浓度IC50为13.7 ng/mL,线性检测范围(IC20-IC80)为7.0-80.5 ng/mL,IC10为4.5 ng/mL。最低检测限尚未达到国家饮用水中MC-LR的1 ng/mL限量要求。（2）微囊藻毒素LR抗独特型抗体的筛选与鉴定。以抗MC-LR单抗为靶标分子,对驼源天然纳米抗体库经过三轮“结合-洗涤-洗脱-扩增”淘选,成功淘筛到了4个阳性克隆（B5,D11,F7,E8）,其中F7和E8结合活性最高。经菌液PCR验证和DNA测序最终获得3个阳性克隆均具有不同的氨基酸序列。筛选出的3株抗独特型纳米抗体可与MC-LR单抗特异性结合而不影响单抗与MC-LR结合,无抑制作用,判定这3个抗独特型抗体的亚型为Ab2α。选取结合信号最强的E8阳性克隆进行后续实验。（3）基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的微囊藻毒素新型免疫检测方法的建立。试验首先对第二章建立的微囊藻毒素LR间接竞争免疫分析方法的孵育时间进行了优化,结果表明3 h为最佳孵育时间,检测方法的IC50提高了2.97倍。随后尝试利用噬菌体衣壳的信号放大作用以及Ab2α抗体的非竞争抑制特性,建立了基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的新型微囊藻毒素免疫分析方法。在最佳优化条件下,测定的噬菌体ELISA的抑制中浓度IC50为2.8 ng/mL,线性检测范围(IC20-IC80)为1.2-6.9 ng/mL,IC10为0.8 ng/mL,达到国家饮用水中MC-LR限量要求。相较于传统ELISA,新型ELISA的检测灵敏度(IC10)提高了5.6倍,且MC-LR单抗的工作浓度从6.25 ng/mL降低为2.86 ng/mL,节省了单抗使用量。通过对E8进行可溶性表达,测定的基于可溶性E8的新型ELISA检测方法的抑制中浓度IC50为14.8 ng/mL,没有提高灵敏度的作用,由此推断是噬菌体衣壳的信号放大作用提高了检测灵敏度。接着测定了新型噬菌体ELISA检测方法对MC同系物MC-RR、MC-YR和MC-LA的交叉反应率。对应的交叉反应率分别为99.2%、107.0%和48.0%。最后对空白自来水样进行MC-LR的添加回收试验,新型ELISA法和HPLC法的添加回收率分别在89.3-99.3%和97.1-114.3%之间,R~2为0.9535,两种方法之间具有良好的相关性。本文探索了α型抗独特型噬菌体纳米抗体在提高免疫检测方法灵敏度方面的新应用。建立的新型微囊藻毒素免疫分析方法,有潜力用于饮用水中微囊藻毒素的快速筛查检测。
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