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【目的】探究转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、CD4~+CD25~+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)、叉头状/翼状螺旋转录因子3(forkhead or winged helix transcription,FOXP3)细胞免疫调节机制;观察中医药多途径介入肾虚肝郁血瘀型再次IVF-ET长方案患者治疗前后外周血TGF-β1、Treg及FOXP3表达水平的变化,比较治疗前后表达水平的差异,并分析TGF-β1、Treg、FOXP3表达水平变化与临床疗效的相关性,探究中医药多途径干预调控再次IVF-ET长方案患者的免疫耐受机制,给中医药临床助孕提供理论支撑。【方法】1. 根据纳入标准和排除标准纳入2016年09月至2018年02月于四川大学华西第二医院长方案失败后拟再次行IVF-ET长方案肾虚肝郁血瘀型患者20例,分为治疗组和自然等待组,每组各10例。治疗组于成都中医药大学附属医院中医妇科予中药口服、穴位贴压、直肠导法治疗3个月;同期纳入的自然等待组于长方案失败后自然等待3个月。治疗组患者分别在干预前和干预3个月后的黄体中期,即LH峰后6～7天[d(LH+6)],P≥5ng/ml,Gn RH-a启动前抽取空腹静脉血5ml;自然等待组在IVF-ET失败后和自然等待3个月后于相同时间点抽取空腹静脉血5ml。2.采用ELISA方法检测外周血TGF-β1、FOXP3蛋白表达量;同时应用实时荧光PCR技术检测外周血TGF-β1m RNA、FOXP3m RNA的表达量;采用流式细胞术分析Treg细胞表达量,在Excel中将检测的数据资料录入整理后,对录入的数据采用SPSS 25.0统计软件进行统计比较与分析。采用空白对照和自身前后对照方法,观察两组患者再次IVF-ET前后妊娠结局及中医证候疗效的情况、患者自身前后及两组之间的外周血TGF-β1、FOXP3及Treg细胞表达水平的变化,分析他们表达水平变化之间的相关性,探讨中医药多途径介入以补肾益精、疏肝活血法干预再次IVF-ET患者调节免疫耐受及助孕的作用机制。【结果】1. 自然妊娠率:两组各10例IVF-ET失败拟再次行IVF-ET长方案患者,治疗组干预期间自然妊娠3例,自然等待组等待后IVF-ET治疗前自然妊娠0例。治疗组自然妊娠率高于自然等待组(P<0.05)。2. 再次IVF-ET妊娠结局:治疗组7例行再次IVF-ET长方案治疗,其中3例IVF-ET着床成功;自然等待组10例行再次IVF-ET长方案治疗,2例IVF-ET着床成功,其中包含1例生化妊娠。治疗组临床妊娠率高于自然等待组(P<0.05)。3. 中医证候积分及疗效:治疗组患者多途径干预后肾虚肝郁血瘀型中医证候积分值明显较干预前降低(P<0.05);自然等待组患者未行中医药干预等待前后肾虚肝郁血瘀型证候积分值差异不明显(P>0.05)。两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组中医证候疗效总有效率显著高于自然等待组(P<0.05)。4. TGF-β1:治疗组中医药多途径干预后TGF-β1蛋白、TGF-β1m RNA表达水平明显高于干预前(P<0.05);自然等待组未行中医药干预等待前后TGF-β1蛋白、TGF-β1m RNA表达水平差异不明显(P>0.05);两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组干预后TGF-β1m RNA表达水平高于自然等待组等待后水平(P<0.05)。5. FOXP3:治疗组中医药多途径干预前后比较,FOXP3蛋白、FOXP3m RNA表达水平干预后明显高于干预前(P<0.05)。自然等待组未行中医药干预等待前后FOXP3蛋白、FOXP3m RNA表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)。两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组FOXP3m RNA表达水平治疗组高于自然等待组(P<0.05)。6. Treg:治疗组中医药多途径介入干预三个月后Treg表达水平明显高于干预前(P<0.05);自然等待组等待前后Treg细胞表达水平差异无明显变化(P>0.05);两组干预/等待三个月后,两组间比较,治疗组干预后Treg表达高于自然等待组等待后表达水平(P<0.05)。7. TGF-β1与Treg表达水平呈正相关(r=0.649,P=0.042),中医证候积分变化与FOXP3值(r=-0.363,P=0.021)、Treg值(r=-0.334,P=0.035)前后变化呈负相关性。8.3例自然妊娠患者的外周血TGF-β1、FOXP3、Treg表达在中医药多途径干预后均升高;TGF-β1、FOXP3及Treg在干预/等待前后表达水平趋势升高在5例IVF-ET着床成功患者中所占的比例分别是80.0%、80.0%、100%,在8例妊娠患者中分别是87.5%、87.5%、100%。TGF-β1与Treg的变化趋势与妊娠结局有统计学意义(P<0.05)。【结论】中医药多途径干预肾虚肝郁血瘀型IVF-ET长方案失败患者可改善患者妊娠结局及肾虚肝郁血瘀型中医临床症状;初步得出其机制可能是:以补肾益精、疏肝活血法的中医药多途径治疗,可上调IVF-ET长方案移植失败患者外周血TGF-β1的表达水平,诱导Treg细胞的“核转录因子、重要调控基因”FOXP3的表达,促使初始性CD4~+T细胞分化成Treg细胞,使母胎界面局部Treg细胞表达量得以扩增,介导母胎免疫耐受,发挥免疫抑制作用,保护半同种异体移植物免受母体免疫的攻击而顺利植入,从而帮助着床。