论文部分内容阅读
酿酒酵母发酵是燃料乙醇生产的核心。提高发酵终点乙醇浓度,不仅可以节省乙醇精馏能耗,而且显著减少废糟液量。酿酒酵母高温耐受性较差(≤34℃),特别在夏季高温季节,乙醇发酵装置无法使用常规循环冷却水进行降温,需要设备投资大和运行能耗高的低温冷却水,而提高酵母的高温发酵性能可有效解决此问题。木质纤维素类生物质资源非常丰富,广泛分布,可作为燃料乙醇生产可持续的原料来源,但其预处理过程会产生乙酸、糠醛、羟甲基糠醛及酚类化合物等副产物。高浓度乙醇、高发酵温度及毒性副产物均对酵母生长和代谢产生明显的胁迫,影响发酵效率。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SPSC01是由本课题组选育,具有絮凝性状的专利菌株,已应用于燃料乙醇生产。虽然该菌株自絮凝分子机理已阐明,但这一表型对环境胁迫耐受性的影响尚未探究。基于此,利用比较基因组与转录组联合分析SPSC01胁迫耐受性,筛选潜在的改造基因,构建单基因敲除与过表达的突变体,鉴定基因的胁迫耐受功能,为工业酵母改造提供新思路,具有重要的理论意义和实际应用价值。1)SPSC01自絮凝表型对酵母细胞环境胁迫耐受性的影响通过外源添加甲酸、乙酸、丙酸、糠醛、香草醛及香草酸,以及乙醇和施加高温的摇瓶发酵,以非絮凝模式菌株S288c和非絮凝的FLOI基因敲除菌株SPSCO1△FLOl为双对照,研究SPSC01自絮凝对环境胁迫的耐受性。结果显示SPSC01细胞生长和乙醇产量均优于对照菌株,表明酵母细胞自絮凝显著提高其对多种抑制因子的胁迫耐受性。2)比较基因组学和转录组学分析和筛选胁迫耐受性相关基因参照S288c,测序SPSC01基因组,分析基因变异与遗传进化关系。SPSC01基因组约为 15.35 Mb,编码 5315 个基因,含 80388 个 SNPs,2983 个 Inserts 和 2991 个 Deletions等。基因编码区50165个SNPs中有错义突变17902个,对应4667个突变基因。鉴于比较基因组分析而获得的突变基因可能不具有转录调控作用,连续乙醇发酵(胁迫)条件下,以SPSC01AFOl为对照,SPSC01转录组测序结果表明801个基因差异表达,其中541个基因上调,260个基因下调。KEGG聚类基础上,SPSC01错义突变基因谱偶联基因差异表达谱,构建SPSC01胁迫耐受基因库,通过qPCR验证与SGD基因注释信息,遴选出基因YCR049C和MIGl。3)YCR049C对酿酒酵母的乙醇耐性和乙醇发酵的调控作用YCR049C位于第Ⅲ号染色体,预测为跨膜蛋白。外源添加乙醇胁迫时,鉴定出YCR049C响应乙醇浓度。敲除YCR049C能显著提高菌株的乙醇耐受性,并增强S288c和SPSC01的超高浓度(VHG)乙醇发酵性能。转录组测序结果表明,S288c菌中缺失YCR049C导致583个基因上调,431个基因下调,特别是硫胺素代谢途径受到全面影响和显著调控。谷胱甘肽代谢与YCR049C敲除引起的乙醇胁迫耐受有强联系。首次证明了敲除YCR049C提高酿酒酵母的乙醇耐性和发酵性能以及初步揭示其潜在的调控关系。4)SPSC01中MIGl突变对酿酒酵母的高温胁迫耐受性的贡献酵母菌株中敲除MIG1及过表达MIGl-S288c和MIGl.SPSC01基因,研究其对乙酸、乙醇、高温胁迫耐性的影响,结果表明6525与SPSC01中过表达MIGl-SPSC01显著增强高温耐受性。以6525为对照,6525MIGl-S288c有34个基因差异表达,6525MIGl-SPSC01有177个基因差异表达。而相对于6525 MIGl.S288c,6525 MIGI-SPSC01有16个基因上调,8个基因下调。相比于6525,6525 MIG1-S288c与6525 MIGl-SPSC01的HSP30表达量分别上调1.32倍和2.63倍,后续实验证明MIG1-SPSC01过表达诱导的高温耐受性提高与热激蛋白Hsp30转录水平提高具有相关性。MIGl-sPSC01有3处碱基突变,对应71位和399位的氨基酸突变,它们在高温耐性中具有关键的协同作用。Mig1的N端P71L突变在锌指结构的Loop中;C端F399S突变中,苯丙氨酸的苯环比丝氨酸的支链在空间上更加突出,与α-螺旋上的360位点的谷氨酰胺(Gln)产生空间位阻,苯环最远端C(ζ)与最接近的谷氨酰胺支链C(γ)的原子距离为1.0 A,经突变后,丝氨酸支链上O原子与其原子距离变为3.5 A,空间直线距离增加2.5 A。此外,多株酿酒酵母的MIG1基因测序分析出399位极可能是突变热点。5)过表达MIGl-SPSC01对木糖代谢和联合生物加工过程的影响木糖工程菌YB-2625-T中过表达MIGl-SPSC01基因,能够增强其利用木糖促进细胞生长的能力;混合糖发酵中,减少了木糖醇的积累,提高了木糖代谢途径的关键酶的活性;纯木糖发酵中,木糖工程菌的木糖代谢能力受到调节和改善。细胞表面展示纤维素酶的MNII/cocδBEC3菌株中,过表达MIGl-SPSC01提高其高温耐性,提升以磷酸膨胀纤维素(PASC)为底物的CBP(40℃)发酵,通过减少菌体接种量且提高发酵温度,可促进更多乙醇的生成;菊芋秸秆CBP(42℃)发酵中,过表达菌株的乙醇产量增高,酶解底物的纤维素含量减少29.4%,滤纸酶活增加14.7%。综上,本文验证了 SPSC01自絮凝与环境胁迫耐受性的关系,深度阐述了 SPSC01的基因变异和基因表达。通过基因组学和转录组学联合分析,筛选出胁迫耐受性基因。发现和验证了YCR49C和MIGl-SPSC01基因的胁迫耐受功能,为构建乙醇发酵性能优且胁迫耐受性好的工业菌株,用于木质纤维素乙醇生产,提供了科学依据和应用支持。