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目的应用荧光定量RT-PCR技术,分析K562细胞株诱导分化过程中WT1基因及其四种异构体表达水平及比例变化。探讨WT1基因与细胞分化的关系,进一步阐明WT1基因在造血系统细胞增殖、分化中发挥的作用。方法1.建立荧光定量检测系统。2.培养K562细胞,应用终浓度为10ng/ml佛波酯(12 - tetradecanoylphorbol - 13 - acetate ,TPA)诱导K562细胞分化,并采用NBT(硝基四氮唑蓝)还原实验及细胞免疫表型检测判断细胞分化程度。3.实时荧光定量RT-PCR技术定量检测K562诱导分化过程中总WT1基因及其17aa+,KTS+两类异构体的表达水平,β-actin作为内参照。在此基础上计算出WT1(+/+)、WT1(+/-)、WT1(-/+)、WT1(-/-)四种异构体在细胞分化过程中表达水平及比例的变化。结果1.以阳性标准品进行三条标准曲线的建立,其相关系数均达0.995以上。2.随着药物作用时间增加,NBT阳性率及CD9表达阳性率均明显增加(p<0.05)。3.K562细胞诱导分化过程中总WT1出现两次高表达。17aa+、KTS+两类异构体随药物作用时间的延长,其表达比例均逐渐下降。四种异构体比例变化不一致。WT1 (+/+)比例逐渐下降,0小时占0.40±0.19,96小时比例为0.15±0.07。而WT1(-/-)比例逐渐上升,0小时为0.15±0.11,96小时为0.38±0.12,另外两种异构体比例变化没有显著性差异。结论1. TPA可以诱导K562细胞向巨核细胞分化2. TPA诱导K562细胞分化过程中总WT1表达水平首先迅速先下降,之后又再次升高。3. TPA诱导K562细胞分化过程中WT1(+/+)所占比例逐渐下降,WT1(-/-)比例逐渐升高。4. WT1基因在K562细胞诱导分化前后存在两次高表达,但四种异构体构成比例不同,分化前以WT1(+/+)为主,分化后以WT1(-/-)为主,提示WT1基因可能通过调节四种异构体的表达水平而发挥抑分化或促分化的作用。