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纳米孔道生物传感器具有高灵敏、高通量、低成本等优点。作为一种单分子分析的手段,生物纳米孔道在生命分析领域实现了广泛应用,可用于分析蛋白单分子的折叠动态、生物酶活力常数、早期疾病筛查等。根据待测物分子与孔道内部弱相互作用时造成的特征性离子流信号,生物纳米孔道能够在单分子水平上高效快速地获得待测物分子其尺寸、结构、成分等动态行为信息。基于此,本论文以Aerolysin构建成的电化学限域生物纳米孔道,建立了单分子水平分析技术平台,实现对单个DNA片段分子的高灵敏、高分辨的检测。 具体内容如下: 1.Aerolysin纳米孔道单分子分析平台的构建 创新性地构建了Aerolysin电化学限域生物纳米孔道,建立了单分子水平分析技术平台。即使用胰蛋白酶处理后,活化后的Aerolysin单体能够在水溶液中自组装形成七聚体,进而自发插入磷脂双分子层生物膜,此时孔径约为1nm的跨膜蛋白纳米孔道得以构建。该孔道酸碱耐受性良好,可在pH4.0-10.0范围内维持其功能性稳定。利用基于Aerolysin构建的电化学限域生物纳米孔道检测平台,无需任何额外的基团修饰或化学修饰可实现DNA片段分子等生物分子的超灵敏分析。此超灵敏单分子分析平台可应用于直接分辨不同长度的DNA片段以及实时监测核酸外切酶逐步降解单链DNA片段分子的动力学过程。 2.基于Aerolysin纳米孔道的短链DNA片段分子检测 与常用的α-溶血素纳米孔道相比,Aerolysin纳米孔道具有更窄的孔径和更多的正电荷残基,因而在DNA片段分析方面展现出更强的空间和时间分辨能力,无需任何修饰即可实现对仅有三个碱基长度的DNA片段小分子(5’-AGG-3’)的直接检测。其过孔造成的电流阻断程度约为40％。电流阻断时间表现出电压相关性,随着施加电压增大,阻断时间呈指数衰减。此研究为DNA损伤检测等核酸分析提供基础。 3.Aerolysin纳米孔道对具有二级结构的DNA片段分子的分析检测 以一系列不同长度人类端粒序列DNA,5’-(TTAGGG)n-3’为模型分子,改变电解质溶液中阳离子类型,对DNA片段分子进行结构调控,从而实现直接获取易形成大尺寸构型的DNA序列的特征电流信号信息。同时,该体系扩展了DNA研究的长度范围,深入研究了长达三十个碱基长度的DNA单链。统计结果表明,该模型分子的长度与阻断时间呈线性正相关,阻断时间随施加电压呈指数衰减。说明通过阳离子调控使得模型DNA分子从G-四联体到线型结构的转变。该体系的建立,为其它的具有大尺寸构型DNA分子的直接分析提供了一种通用的方法。