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目的 大面积颅骨缺损的修复一直是神经外科临床工作的一个重点,其关键问题是修复材料的来源,而传统的修复材料存在各种各异的缺点。随着组织工程的飞速发展,体外预构的组织工程骨有可能为颅骨缺损提供较理想的修复方式。本试验探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学特性和成骨分化能力,研究以BMSCs为种子细胞、10%珊瑚羟基磷灰石(CHA)为细胞外基质材料构建的组织工程骨的成骨能力。 一、兔BMSCs的生物学特性和向成骨细胞诱导分化的能力 方法 以密度梯度离心法(1.073g/ml的淋巴细胞分离液)和贴壁筛选法获得兔BMSCs,原代培养后1:3传代,分别接种于普通DMEM培养基(A组)和添加成骨诱导剂(含10-9mol/L地塞米松(DEX)、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/LL-抗坏血酸(L-ASC))的DMEM培养基(B组)。定期更换培养基,每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化。用MTT法分析BMSCs在两种培养条件下的生长活力。检测两种培养条件下BMSCs向成骨细胞分化的指标,包括定量法检测第1、2、3、4周时碱性磷酸酶(ALP)的表达,免疫组化法检测第4周时BMSCs分泌Ⅰ型胶原和四环素荧光法检测第5周时矿化结节的形成。 结果 密度梯度离心法和贴壁筛选法从骨髓中获得可贴壁增值、呈纺锤形的BMSCs。在普通培养(A组)和成骨诱导培养(B组)条件下BMSCs从第3天开始快速增值,第8天达到最高峰;在3-8天细胞数两组间有显著差异性。ALP定量检测示A、B两组BMSCs在4周时表达量明显升高,有显著差异性。4周时Ⅰ型胶原免疫组化B组阳性率90%,A组无阳性细胞。5周时矿化结节四环素染色于荧光显微镜下可见B组矿化结节呈黄绿色,A组无矿化结节。 结论 骨髓是良好的间充质干细胞来源,通过密度梯度离心法结合贴壁法能从