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基因治疗是一种新兴发展起来的治疗手段,它为遗传性、恶性及传染性等疾病的治愈提供了可能,但制备高效安全的基因转染载体仍是基因治疗的一个瓶颈。由于非病毒类载体毒副作用小,具有纳米结构的阳离子型聚合物的合成和使用成为近年来该研究领域的研究热点之一。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种研究广泛的阳离子聚合物,它和其他载体的不同点在于其分子骨架上每三个原子就有一个可质子化的N原子,因此,PEI具有较高的pH缓冲能力,易被细胞内吞和从内涵体中逃逸,可以将载带的DNA从载体中释放到细胞质中。许多研究小组研究了直线型和枝权型PEI的制备方法,并且使用PEG化或与其他功能分子共聚等手段对PEI分子进行修饰,以提高PEI的生物相容性、亲水性、生物降解性或靶向性。制备PEI通常使用单体氮丙啶的阳离子聚合方法,但制备特定分子量PEI的合成、纯化步骤复杂,体系中单体及修饰剂残留不利于生物和医学应用。Fenton反应产生高反应活性羟基自由基,常用于引发有机物抽氢和加成反应,也用于废水中有机物的氧化降解处理。在紫外光诱导下的光助Fenton反应其氧化能力明显提高,羟基的生成速率和量子产额因Fe2+的存在而显著提高。
本论文主要研究内容为:在室温下使用光助Fenton反应制备M-PEIs纳米凝胶作为基因转染载体。使用PEI预聚物为合成试剂,使用低压汞灯(辐射253.7 nm的紫外光)为辐照源,反应体系持续通N2以排除O2对合成反应的干扰。通过改变pH值、反应时间和体系中各种试剂浓度,控制M-PEIs纳米凝胶粒径及其zeta电位。所得样品经0.45μm水相针式滤器过滤纯化后,再用透析袋截留分子量大于10000的样品。研究表明纯化后的样品具有更好的稳定性。本论文详细讨论了三种合成体系获得的结果,发现体系B不仅粒径可控性更强,且样品的粒径分布更均匀。
为了探索M-PEIs纳米凝胶粒径对细胞基因转染效率的影响规律,选取38,75,87,121,132和167 nm六种粒径样品,以肝癌细胞Bel-7402、肺癌细胞A549、胃癌细胞BGC-823和卵巢癌细胞Hela四种人类高发肿瘤细胞为细胞模型,进行细胞基因转染研究。MTT实验中没有发现M-PEIs/DNA复合物具有明显的细胞毒性。以pLEGFP-C1为转染基因,使所有研究样品载带质粒DNA质量相同,选择最优M-PEIs:DNA比以使DNA—载体复合物带有少量的正电荷,结果发现75和87 nm的M-PEIs纳米凝胶样品具有最高的基因转染效率。
本论文使用各种谱学对合成的样品进行了系列表征,对光助Fenton反应合成M——PEIs纳米凝胶机理进行了探索,对M-PEIs纳米凝胶粒径及表面电位与细胞基因转染效率的相关性进行了讨论,也对γ射线辐照法制备M-PEIs纳米凝胶方法作了尝试,为阳离子纳米凝胶载体合成及其基因转染研究提供了有益启示。