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鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的淋巴细胞肿瘤性疾病,在全世界范围内曾给养鸡业造成极大的经济损失。从20世纪50年代开始至今人们依次用火鸡疱疹病毒(HVT)、HVT与MDV血清Ⅱ型联用、MDV血清Ⅰ型弱毒株疫苗来接种雏鸡,获得了很好的免疫保护,使该病得到了很好的控制。但是到20世纪90年代后期,新出现的MDV超超强毒已经能够突破疫苗的免疫保护屏障,在免疫鸡群中引发MD。MDV L-ZY毒株是2006在我国东北地区分离的MDV超强毒株,可导致70%HVT免疫鸡群发生MD,与近年在国内分离的几个超强毒株亲缘关系较近,具有一定的地方流行性和代表性。超强毒株的出现为人们防控MD带来了新的挑战,研究MDV的致病机理和疫苗免疫保护机理对于防控MD有着非常重要的意义。MDV是严格的细胞结合毒,难于对病毒直接进行基因水平上的操作,最近出现的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)技术成功地解决了这一难题,本研究就是利用BAC技术构建MDV超强毒L-ZY毒株细菌人工染色体感染性克隆。首先,利用黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT)基因表达盒,带有细菌人工染色体基本基因功能序列(pBeloBAC11,7.5kb)及MDV Us2区左右同源臂成功构建了含有两个相同序列方向loxP位点的MDV重组病毒转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11,并且两个相同序列方向loxP位点分别位于BAC-gpt核心序列两侧,以保证选择标记基因和BAC序列在不需要时进行删除。转移载体pUAloxPB-gpt-BAC11经酶切、PCR鉴定和两个loxP位点间序列的剪切测试完全正确。利用同源重组的方法,运用磷酸钙转染技术,将提取并纯化的转移载体与MDV感染CEF细胞的总DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF),待启动病毒感染后,利用GPT加压筛选标记,通过改进的加压筛选方法,经过6轮的加压筛选富集并获得了Us2区插入miniF核心序列的L-ZY BAC重组病毒。适时提取L-ZY BAC重组病毒感染细胞基因组总DNA,将其电转入DH10B感受态细胞中,获得L-ZY BAC(鸡马立克氏病病毒L-ZY株全基因组细菌人工染色体),经过PCR、凝胶电泳鉴定总共获得21个阳性克隆。将提取纯化的L-ZY BAC21转染次代CEF细胞,再次启动了病毒感染,产生了MDV特异性病毒蚀斑,拯救出了纯系重组病毒——derived-MDV LZY21。本研究成功构建了MDV血清Ⅰ型超强毒L-ZY株细菌人工染色体,从而完善了MDV细菌人工染色体反向遗传操作系统技术平台,为研究MDV的致瘤机制、潜伏机制、基因功能以及新型MDV疫苗的开发奠定了良好的基础。