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NIK,也被称为MAP3K14,在免疫细胞功能发挥和肝脏代谢中都发挥着重要作用。在一些细胞因子的刺激下,NIK能够激活NF-κB2非经典信号通路。因此,NIK稳定性调控是NIK活性发挥的关键步骤。在静息细胞状态中,细胞中NIK蛋白水平能够被泛素-蛋白酶体途径迅速降解,因而始终保持非常低的水平。本研究中发现CHIP(Carboxy terminus of Hsc70 interacting protein)蛋白是一个新发现的能与NIK相互作用,并最终介导NIK蛋白降解的辅伴侣分子。CHIP蛋白包含三个结构域,N端具有三个TPRs、C端的U-box结构域和中间的二聚体结构域(也被称为charge结构域)。其中U-box结构域具有E3泛素连接酶功能,能够泛素化结合蛋白并介导其降解。首先,体外实验部分,本研究从多方面证实了CHIP能够介导NIK蛋白的降解。(1)免疫共沉淀实验证实,CHIP与NIK蛋白存在相互作用且TPR结构域是关键区域;(2)CHIP能够浓度依赖性降解NIK蛋白并且能够缩短NIK蛋白半衰期,但是CHIP(K30A)因为不能与NIK蛋白相互作用,因而不能继续介导NIK蛋白降解;(3)CHIP通过介导NIK蛋白降解,明显抑制了NF-κB2非经典信号通路,p100分解生成p52减少;(4)肝脏特异性过表达NIK的小鼠,产生很严重的肝损伤,肝脏炎症反应甚至小鼠死亡,然而同时过表达CHIP蛋白能够明显缓解这一损伤过程。对于CHIP介导的NIK蛋白降解机制研究,本实验证实CHIP能够增加NIK蛋白的泛素化水平,并且蛋白酶抑制剂处理能够减缓NIK蛋白继续降解,因此推断,CHIP至少有一部分是通过泛素-蛋白酶体系统降解NIK蛋白。随后我们采用转基因小鼠模型进行体内验证,转基因小鼠构建方法是向STOP-NIK小鼠尾静脉注射albumin-cre腺病毒,去除NIK基因前面的STOP位点,进而完成肝脏特异性过表达NIK的转基因小鼠的构建。前期实验结果发现,肝脏特异性过表达NIK后,小鼠出现严重的肝损伤甚至小鼠死亡,既然本研究发现了CHIP作为新型的调控NIK稳定性蛋白,进而探究CHIP是否能通过介导NIK蛋白降解而缓解这一损伤过程。研究结果发现,与前期结果一致,肝脏特异性过表达NIK的对照组小鼠,产生严重的肝损伤和炎症反应,具体表现在以下几个方面:血清谷丙转氨酶(ALT)活性升高,胆红素(Bilirubin)水平明显升高,血糖降低,体重降低,肝脏比重上升。而CHIP处理组的小鼠,虽然也有一定程度的肝损伤和炎症反应,但在以上所有指标上已经都有显著改善(P<0.05)。不仅如此,CHIP组小鼠的肝脏的一些促炎因子水平相比于对照组来说也明显降低(P<0.05),活性氧水平显著降低(P<0.05),且肝脏组织切片显示较少的炎症细胞增殖。总的来说,CHIP能够在一定程度上缓解由于肝脏过表达NIK而造成的肝损伤、肝脏炎症反应和肝细胞凋亡过程,而这个过程的实现很大程度上是通过介导NIK蛋白降解实现的。CHIP能够增加NIK蛋白的泛素化水平,但是CHIP的U-box结构域突变体仍然能够与NIK相互作用且介导其降解,猜测是在此过程中可能有另外一个E3泛素连接酶在起作用,而CHIP可能在这里起到了结构上的支撑作用,因此不需要CHIP发挥自身的泛素连接酶的作用。因此我们发现TRAF3,介导NIK降解的E3泛素连接酶,并且实验结果发现CHIP和TRAF3共转染能够极大程度上促进NIK蛋白降解,远高于单独转染对NIK的降解。免疫共沉淀证实,CHIP和TRAF3存在相互作用且TPR结构域同样是关键作用区域。本实验结果暗示,CHIP在此过程中可能是起到桥梁作用,将NIK和TRAF3连接起来,形成一个新的复合体,达到降解NIK蛋白的目的,而CHIP缓解肝损伤的另外一个可能机制就是通过抑制NIK蛋白的活性。本研究结果总结如下:CHIP和NIK蛋白之间存在相互作用关系且TPR结构域是关键区域;CHIP能够介导NIK的降解而降解机制很可能是通过泛素-蛋白酶体途径;CHIP能通过介导NIK蛋白降解而抑制p100分解成p52;CHIP能通过介导NIK蛋白降解从而缓解肝脏炎症过程,明显改善肝损伤;CHIP和TRAF3存在相互作用且TPR结构域同样是关键作用区域,CHIP和TRAF3相互协作能够极大程度上促进NIK蛋白降解,可能是潜在的另外一个NIK稳定性调控性机制。