龙葵素及莨菪烷类生物碱的中毒、检测及评价研究

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茄科植物对于人类是非常重要的一大科植物,可为人类提供许多种食物和药物,也是有毒植物最重要的科之一。茄科植物的化学成分特征是含有多种莨菪烷类、甾体类和吡啶类生物碱,其中,甾体类生物碱,如龙葵素、澳茄碱等多具抗菌消炎和抗霉菌作用,主要存在于茄属植物如马铃薯中;莨菪烷类生物碱,如阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱,为抗胆碱药物,能扩瞳、解挛、止痛及抑制腺体分泌,多存在于曼陀罗属植物如洋金花中。在我国民间,此类植物常被作为中草药服用,如含龙葵素的植物龙葵等,经炮制后用于治疗癌症及风湿病等;含莨菪烷类生物碱的植物如洋金花等常被泡入酒中作药酒饮用。由于这些植物所含化学成分复杂多样、且含量低毒性大,服用者常因用药不当、过量服用导致中毒或死亡。龙葵素存在于日常食用的主要粮食作物马铃薯中,尤其是在变绿发芽的马铃薯中其含量更高,故实践中常发生因食用了发芽的马铃薯而引发的中毒案(事)件,且常为群体性中毒事件。茄科植物中毒的鉴定及评价技术是法医毒物学研究涉及尚少的领域,由于茄科植物所含成分多样、体内含量低、样品处理复杂而成为法医毒物鉴定的难点问题。虽有相关分析方法和药代方面的零星研究报道,但技术平台、检测对象和方法学指标均难以满足毒物鉴定实践的需求和科学证据的要求。基于上述背景和需求,本研究在现代分析技术的平台上,综合运用液相色谱-质谱联用(LC-(MS)n)的高分离效能和结构确证功能,研究、开发、建立液相色谱-串联质谱检测方法,分析和评价复杂生物体系中龙葵素和莨菪烷类生物碱;设计、初步创建甾体类生物碱龙葵素的中毒实验模型,考察目标物在体内的吸收、分布、代谢、排泄等毒代动力学相关问题,探索、确立有毒动植物中毒鉴定的取材方案和评判依据,为有毒动植物的科学研究、中毒鉴定、临床诊断及救治、食品安全监测等提供技术平台,为实际中毒案例提供评价基础和参考信息。本论文的研究内容共分为四章。第一章创建了生物体液及组织中龙葵素的固相萃取-高效液相色谱串联质谱(SPE-LC-MS/MS)的分离分析方法,以及进行的全面系统的方法学验证。方法以美替诺龙醋酸酯为内标,血液、尿液及肝组织中的龙葵素经Oasis HLB固相萃取柱富集、纯化后,LC-MS/MS法检测龙葵素中两种主要成分α-茄碱和α-卡茄碱,方法的检测时间为7min。血液、尿液及组织中α-茄碱和α-卡茄碱与内标美替诺龙醋酸酯分离良好。血液和尿液中α-茄碱和α-卡茄碱在0.5-100ng/mL内均有良好的线性,相关系数>0.995,最低检出限均为0.2ng/mL。回收率均大于50%,基质效应为45%-79%。方法的准确度在80%-120%之间,日内精密度与日间精密度(RSD)均小于10%。所建方法灵敏度高、选择性好,前处理方法方便有效,可用于法医毒物分析和临床药物检测及食品安全监测中龙葵素的测定。第二章初步建立了马铃薯提取物-龙葵素的中毒实验模型。通过动物实验,观察龙葵素给药后,动物的中毒症状以及变化。运用本研究创建的SPE-LC-MS/MS方法,研究龙葵素的毒性剂量下对大鼠单次灌胃给药后,其两种主要成分:α-茄碱和α-卡茄碱在血液中的浓度随时间变化的趋势,尿液中的排泄情况以及龙葵素致大鼠急性中毒死亡后的组织分布情况。结果表明在本研究的给药剂量下,α-茄碱和α-卡茄碱在血液中的浓度随时间的变化有两种趋势,大鼠对龙葵素的吸收存在着较明显的个体差异。排泄研究表明,龙葵素以药物原形随尿液排出量较少,可推测以其他形式排出体外。大鼠急性中毒死亡后组织分布的研究结果表明,α-茄碱α-卡茄碱在各组织中的分布情况基本一致,在小肠、胃、肝、肾中含量较高;研究还表明雌性大鼠的生殖器官中(子宫和卵巢)药物的浓度较雄性大鼠生殖器官中(睾丸)的药物浓度大,两者有着明显的差别。研究结果可对龙葵素中毒鉴定及评价提供指导信息和参考依据。第三章创建了血液和尿液中的3种莨菪烷类生物碱的LC-MS/MS检测方法,以及进行的全面系统的方法学验证。血液或尿液以后马托品为内标,经液液提取后,LC-MS/MS法分析阿托品、东莨菪碱及山莨菪碱。血液、尿液中阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱与内标后马托品分离良好,3种化合在0.05-100ng/mL(血液)、0.2-100ng/mL(尿液)内均有良好的线性,相关系数>0.9990,最低检出限为0.02ng/mL。方法回收率除山莨菪碱外均大于50%,日内精密度与日间精密度(RSD)均小于10%。所建立的LC-MS/MS方法灵敏度高、操作简便快速、准确,适用于血液及尿液等生物检材中痕量阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱成分的同时检测。第四章总结了本论文课题的研究成果及创新点,并提出进一步的研究方向,为深入探讨龙葵素或莨菪烷类生物碱的中毒鉴定与评价提供研究基础。本论文的创新点及研究意义如下:1.本研究创建的血液、尿液及组织中的龙葵素定性定量分析方法简单、快速、灵敏、可靠,为国内首创的生物检材中龙葵素的分析方法,较国外已有方法更简便、快速,适用于龙葵素中毒的法医学鉴定、临床诊治及食品安全监测。2.首次研究了马铃薯龙葵素提取物的毒性剂量下,α-茄碱和α-卡茄碱在大鼠体内的血药浓度随时间的变化趋势。初步考察了α-茄碱和α-卡茄碱在体内的毒代动力学情况。初步考察了毒性剂量下龙葵素随尿液的排泄情况。3.首次研究了在龙葵素急性中毒死亡的大鼠组织中α-茄碱和α-卡茄碱的分布特征;并首次考察在大鼠生殖器官中的分布状况,发现α-茄碱和α-卡茄碱在雌性、雄性大鼠生殖器官中的分布存在较明显的差异。4.创建了同时快速分析生物检材中3种莨菪烷生物碱的LC-MS/MS方法,所建方法简便、灵敏、快速、可靠,能满足曼陀罗中毒后生物检材中东莨菪碱、阿托品、山莨菪碱的同时检测,为曼陀罗花果中毒后的法医学鉴定、临床诊断及救治提供了科学的手段。本研究成果部分填补了法医毒物学领域龙葵素和莨菪烷类生物碱中毒鉴定及评判的空白,可应用于法医学中毒鉴定实践,并为临床诊治提供科学的手段。
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