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汉坦病毒是肾出血热综合症和汉坦病毒肺综合症两种严重临床疾病的致病因子,其致病机理复杂,临床表现多样,病死率高,因而对汉坦病毒的早期诊断非常重要。目前已建立的诊断方法主要有血清学方法和基因检测方法,但前者费时费力且灵敏度不高,后者又常常会导致假阳性,因而急需建立一种快速、简便且灵敏度、准确性和特异性高的检测方法。由于汉坦病毒核蛋白(NP蛋白)已被证实是病毒感染早期产生量最多的病毒蛋白且具备很好的抗原性的,NP蛋白可作为检测汉坦病毒感染的重要指标,因而建立NP蛋白的检测方法将有利于汉坦病毒感染的早期诊断。
本研究在最近发展的生物条形码扩增(BCA)检测方法基础上,发展了一种基于纳米金扩增的免疫PCR技术,用于超灵敏度检测汉坦病毒NP蛋白。在本方法中,首先将多克隆抗体固定在微孔板上,捕获NP蛋白,再加入双功能化的纳米金颗粒,该纳米金颗粒表面同时结合了NP特异的单克隆抗体和巯基化DNA(capture DNA,C-DNA),后者杂交结合了一条互补的DNA分子(Barcode DNA,B-DNA)。纳米金颗粒识别结合抗原,形成免疫夹心复合物。最后加热释放杂交结合在纳米金上的B-DNA分子,再通过PCR方法进行定量分析,从而实现对NP蛋白的检测。
实验结果表明,本研究建立的检测方法对NP蛋白的检测极限(LOD)可低至10 fg/mL,即约0.2 aM,比传统ELISA法的LOD低7个数量级;同时用胎牛血清制备的样品进行检测时,本检测方法的灵敏度未发生显著的变化,表明本方法的灵敏度不受复杂的样品基质影响,具有直接检测临床样品的潜力。
本研究发展的这种基于生物条形码扩增的免疫PCR(BCA-IPCR)方法,能对汉坦病毒NP蛋白进行超灵敏度的检测,因而有潜力用于汉坦病毒感染早期的临床诊断。