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目的:利用肝癌相关抗原Cdc25C过表达的树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL),体外分析CTL对肝癌细胞的杀伤作用,初步探讨将Cdc25C应用于肝癌免疫治疗的可行性。
方法:(1)构建Cdc25C慢病毒载体(LV-Cdc25C),用其转染小鼠DC2.4细胞系作为实验组(LV-Cdc25C-DC2.4),另设空白对照组(DC2.4)和阴性对照组(LV-DC2.4);通过RT-PCR和Westernblot技术检测三组DC2.4细胞中Cdc25C的表达。(2)流式细胞术对三组DC2.4细胞进行表型鉴定,并用ELISA法检测三组DC2.4细胞培养液中IL-12、IL-10、IL-6和IFN-γ的分泌量。(3)通过流式细胞术检测来源于C57BL/6小鼠Hepa1-6肝癌细胞的MHC-I的表达情况,运用RT-PCR法检测Hepa1-6肝癌细胞的Cdc25C的表达情况。(4)利用美天旎磁珠分选试剂盒从C57BL/6小鼠的脾脏中分选CD8+T细胞,利用流式细胞术对CD8+T细胞进行鉴定,然后和DC2.4细胞共培养一周后作为效应细胞(CTL),最后用ELISA法检测CTL培养液中IL-2、granzymeB、PRF1的分泌量。(5)采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测Cdc25C特异性CTL对靶细胞的免疫杀伤作用,以及用MHC-I单克隆抗体封闭靶细胞MHC-I位点对杀伤作用的影响。
结果:(1)成功构建LV-Cdc25C慢病毒载体,并转染DC2.4细胞。在倒置荧光显微镜下发现,DC2.4组无荧光蛋白表达,LV-DC2.4组和LV-Cdc25C-DC2.4组可见明显绿色荧光蛋白表达;在LV-Cdc25C-DC2.4组中,Cdc25CmRNA和蛋白表达水平明显高于DC2.4组和LV-DC2.4组。(2)流式细胞术分析结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组和另两组相比,CD80、CD86和CCR7表达明显上调,说明LV-Cdc25C可以提高DC2.4的表面标志物的表达;ELISA检测结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-10分泌水平逐渐增加,与空白对照组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)流式细胞术检测结果发现小鼠Hepa1-6肝癌细胞表达MHC-I;RT-PCR结果显示小鼠Hepa1-6肝癌细胞表达Cdc25C。(4)流式细胞术检测结果发现,CD8+T细胞占总细胞97.8%;ELISA法检测CTL培养液结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组CTL分泌的IL-2、granzymeB、PFR1与DC2.4组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)TRFIA结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组诱导的CD8+T细胞对Cdc25C阳性的小鼠Hepa1-6肝癌细胞具有明显的杀伤效应,其杀伤率明显高于其他两组(P<0.05);CTL对封闭了MHC-I位点的靶细胞无明显杀伤效应。
结论:在体外用LV-Cdc25C转染的DC2.4细胞可诱导CD8+T细胞形成CTL,并产生较强的细胞免疫应答,提示Cdc25C树突状疫苗具有肝癌免疫治疗潜能。
方法:(1)构建Cdc25C慢病毒载体(LV-Cdc25C),用其转染小鼠DC2.4细胞系作为实验组(LV-Cdc25C-DC2.4),另设空白对照组(DC2.4)和阴性对照组(LV-DC2.4);通过RT-PCR和Westernblot技术检测三组DC2.4细胞中Cdc25C的表达。(2)流式细胞术对三组DC2.4细胞进行表型鉴定,并用ELISA法检测三组DC2.4细胞培养液中IL-12、IL-10、IL-6和IFN-γ的分泌量。(3)通过流式细胞术检测来源于C57BL/6小鼠Hepa1-6肝癌细胞的MHC-I的表达情况,运用RT-PCR法检测Hepa1-6肝癌细胞的Cdc25C的表达情况。(4)利用美天旎磁珠分选试剂盒从C57BL/6小鼠的脾脏中分选CD8+T细胞,利用流式细胞术对CD8+T细胞进行鉴定,然后和DC2.4细胞共培养一周后作为效应细胞(CTL),最后用ELISA法检测CTL培养液中IL-2、granzymeB、PRF1的分泌量。(5)采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测Cdc25C特异性CTL对靶细胞的免疫杀伤作用,以及用MHC-I单克隆抗体封闭靶细胞MHC-I位点对杀伤作用的影响。
结果:(1)成功构建LV-Cdc25C慢病毒载体,并转染DC2.4细胞。在倒置荧光显微镜下发现,DC2.4组无荧光蛋白表达,LV-DC2.4组和LV-Cdc25C-DC2.4组可见明显绿色荧光蛋白表达;在LV-Cdc25C-DC2.4组中,Cdc25CmRNA和蛋白表达水平明显高于DC2.4组和LV-DC2.4组。(2)流式细胞术分析结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组和另两组相比,CD80、CD86和CCR7表达明显上调,说明LV-Cdc25C可以提高DC2.4的表面标志物的表达;ELISA检测结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-10分泌水平逐渐增加,与空白对照组相比,其差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)流式细胞术检测结果发现小鼠Hepa1-6肝癌细胞表达MHC-I;RT-PCR结果显示小鼠Hepa1-6肝癌细胞表达Cdc25C。(4)流式细胞术检测结果发现,CD8+T细胞占总细胞97.8%;ELISA法检测CTL培养液结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组CTL分泌的IL-2、granzymeB、PFR1与DC2.4组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)TRFIA结果显示,LV-Cdc25C-DC2.4组诱导的CD8+T细胞对Cdc25C阳性的小鼠Hepa1-6肝癌细胞具有明显的杀伤效应,其杀伤率明显高于其他两组(P<0.05);CTL对封闭了MHC-I位点的靶细胞无明显杀伤效应。
结论:在体外用LV-Cdc25C转染的DC2.4细胞可诱导CD8+T细胞形成CTL,并产生较强的细胞免疫应答,提示Cdc25C树突状疫苗具有肝癌免疫治疗潜能。