核酸药物作为目前国际上重点关注的一类新型生物技术药物,具有设计方便、应用性广、特异性强、不易产生耐药等特点。核酸药物以与疾病发展进程紧密相关的mRNA等核酸序列为靶标,由于蛋白序列编码以及碱基配对特异性,核酸药物具有“治标治本”的优点和巨大的应用前景。已上市的核酸药物种类包括si RNA、反义核酸、核酸适配体,其他核酸药物还包括核酶、sa RNA等。反义核酸作为核酸药物的重要类别,开发最为成熟。反义核酸通过反义机制调节mRNA和蛋白表达,相关机制包括与mRNA的杂交阻断翻译过程或激活RNase H使靶标mRNA降解,或与pre-mRNA上的剪接位点结合,改变成熟mRNA中的外显子含量。自1998年第1个反义药物Vitravene TM被美国FDA批准上市,2013年以来Mipomersen,Eteplirsen,Nusinersen,Tegsedi等也相继获批上市。尽管取得极大的进步,然而,由于核酸药物的负电性、酶易降解性、以及生物体内存在多重生物学屏障,导致其低效率的胞质传递,肝脏快速清除。到目前为止,核酸药物的有效递送依然是有待解决的主要问题。对核酸药物采用各种递送载体和进行化学修饰是近年来发展的主要策略。递送载体主要包括阳离子脂质、聚乙烯亚胺或脂质体制剂等,它们通过静电作用与带负电荷的寡核苷酸相互作用,在亲水性介质中自组装。这种策略将寡核苷酸压缩成聚合体,经内吞进入细胞后释放,目前已有的转染试剂包括Oligofectamine 2000（Invitrogen）,Jet PEI（Polyplus transfection）,K2（Biontex）等[1]。然而,转染试剂的潜在生物毒性等问题仍有待深入阐明。化学修饰主要是在分子水平上,通过对寡核苷酸的碱基、核糖、磷酸盐或末端进行结构修饰以改善其理化性能,此外,还包括缀合PEG等策略,实现体内长效循环和靶向性等。这些进展提供了大量独特的新生物大分子,但化学修饰也存在降低结合亲和力,带来不良反应等潜在隐患。需要指出的,在扩大修饰的组成多样性以及自组装体系的构效关系方面仍存在着重要的机遇,这些策略将进一步促进核酸药物更有效、更多样性的产品开发。寡核苷酸的治疗在临床上还处于起步阶段,与先进诊疗手段的结合也将成为未来寡核苷酸治疗的发展趋势。在分子水平上,新的功能化寡核苷酸的设计、优化是临床成功的关键,也是寡核苷酸治疗革命的核心。研究发现,核酸序列通过碱基互补配对形成的高级结构在人体内天然存在,一些具有高级构象的核酸分子,如发夹状、环状、四螺旋等,由于其特殊的构象改变（磷酸和碱基的排列和碱基堆砌作用）,得以调节理化性质,包括改善抗酶解稳定性等。基于构象带来的理化性质改变,进一步设计具有新结构特征或作用机制的核酸药物,可为相关领域的研究和应用提供全新的思路和更多的可能性,具有重要的科学价值。本研究从分子构象角度出发,融合核酸前药的设计概念,以提高酶解稳定性为目标,进行三类新结构类型的分子设计,包括:1.基于碱基识别自组装的末端发夹结构设计。2.基于碱基识别自组装的末端发夹缀合PEG结构设计。3.基于化学键连的订书结构设计。这三类新结构分子不仅具有前药基本特征即增加药物稳定性,促使药物长效化等,并且可经体内特定环境响应发生敏感键断裂转化为原药结构。1、基于碱基识别自组装的末端发夹结构设计我们以抗肿瘤反义核酸GTI-2040为模型分子,设计合成了一系列的带有可条件响应性断裂二硫键的前药型核酸分子,经溶液退火自组装成末端发夹结构。这些核酸分子具有以下两个特点:（1）末端发夹结构从空间构象上提高了核酸前药分子的耐酶解能力（2）敏感键在肿瘤高浓度谷胱甘肽还原性条件下发生断裂,分子末端发夹结构中的螺旋（茎）区由一条链回折形成碱基配对变为两条链之间的碱基配对,螺旋热稳定性（Tm）发生大幅下降（低于生理温度条件）,从而促使了反义核酸原药从之前的高级结构中解离出来,进一步与靶标结合发挥作用。我们通过一系列的酶解实验（血清、血浆、DNase I）,证实了经发夹结构保护的新结构分子显示出较天然核酸更好的抗酶解稳定性。在模拟肿瘤微环境还原条件下,所有前药分子均可发生二硫键断裂,非变性凝胶电泳实验证明可进一步解离出核酸原药序列。一个优选的分子（2）,在细胞实验和裸鼠肿瘤模型中,有效提高了抗肿瘤细胞增殖效果和体内抗实体瘤活性。2、基于碱基识别自组装的末端发夹缀合PEG结构设计我们在第一部分的结构设计工作基础之上,进一步探索了在分子发夹结构的回折末端引入短链PEG的高效合成方法和抗酶解稳定性变化。通过两种不同的合成方法,均可高效缀合PEG链。体外稳定性试验证实了发夹结构分子PEG化可进一步增加其抗酶解稳定性,体外模拟肿瘤还原条件下,两种缀合了PEG的发夹分子均可发生二硫键断裂,非变性凝胶电泳实验证明可进一步解离出核酸原药序列。3、基于化学键连的订书结构设计在本部分工作中,我们通过一种简单实用的化学方法设计了具有刺激响应特征的分子内成环的订书结构型前药反义核酸。即以两端羰基溴化物修饰的双（2-羟基乙基）二硫化物为订接分子,与核酸序列中硫代磷酸（PS）修饰的硫醇基团反应,即从两硫代位置形成核酸分子内局部或整体的成环结构。采用质谱和非变性凝胶电泳证实了订书结构的形成。体外酶解稳定性实验表明,订书结构反义核酸显示出良好的血清稳定性。订接分子中的二硫键经还原剂DTT处理发生断裂,可转化为线性核酸分子与靶标结合发挥作用。抗肿瘤细胞增殖实验表明,订书结构反义核酸相比天然序列提高了反义活性。综上,本课题从核酸分子构象角度展开设计,将经典的前药原理融合至反义核酸结构之中,设计的新分子具有独特的条件响应特征、构象动态转化、热力学释放等机制。本研究可为核酸药物的构象与稳定性关系研究提供有价值的参考,也为更多核酸分子结构设计提供了新的实践。