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研究背景与目的:脑卒中是导致死亡和长期残疾的主要原因。缺血性脑卒中占脑卒中发生比例的60%-70%,其发病机制是由动脉栓塞,引起微血管疾病或损伤,导致大脑缺氧和缺乏葡萄糖,这些伤害进一步导致脑损伤和神经损伤;及时的血液再灌注是至关重要的减少脑细胞损伤的方法,然而,恢复血液供应后导致缺血脑组织更严重的损伤:缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）损伤,进一步加剧大脑不可逆性损伤。其中神经元大量凋亡是导致脑缺血再灌注后脑组织损伤加重的重要因素。因此,抑制凋亡作为一种减少缺血性脑卒中损伤的方法被研究。Cezanne是卵巢肿瘤相关蛋白酶（Ovarian tumor-associated protease,OTUs）家族去泛素化酶（Deubiquitinating cysteine protease,DUBs）的成员之一。Cezanne可以从lys11相关的多泛素链中裂解泛素键,并参与由泛素调控的多种细胞功能。目前的研究表明,Cezanne可以调节细胞周期,促进肿瘤生长,抑制NF-KB介导的炎症反应通路。Cezanne的研究主要集中在癌症的治疗上,而目前在脑卒中的研究还是空白,考虑Cezanne可能影响细胞的生长及凋亡过程,因此,我们开展了Cezanne在缺血性脑卒中中的研究。Sirtuins蛋白家族是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶,它调节许多生物过程,如细胞新陈代谢,脱氧核糖核酸（Desoxyribonucleic acid,DNA）修复,细胞存活、细胞死亡,凋亡等,被认为是治疗人类广泛的病理过程的潜在治疗标靶。在Sirtuins家族中,特异性定位于细胞核的SIRT6能促进DNA损伤修复、氧化应激的抵抗,并且能够抑制基因组的不稳定性。SIRT6在大脑血脑屏障中呈高表达,并且可以减轻心肌和肝脏I/R损伤。最近的研究表明,SIRT6也可能在脑I/R损伤中发挥保护作用。我们已知I/R损伤的发病机制与DNA损伤导致的细胞死亡有关;I/R损伤后的DNA损伤发生在缺血再灌注的早期,随着再灌注时间的延长,DNA损伤加重,DNA双链断裂（DNA double-strand break,DNA DSB）发生。严重的DNA损伤可以触发p53介导的细胞凋亡通路,这具体取决于DNA损伤的严重程度。SIRT6可以通过对p53的赖氨酸382位点去乙酰化来调节p53的转录活性,但在脑I/R中并未对此通路进行探索,因此,在本研究中,我们探索了SIRT6在脑I/R损伤中发挥类似保护作用的机制。p53蛋白是一种非常重要的肿瘤抑制因子,是细胞内多种信号转导通路的连接,是控制细胞凋亡的中心介质。转录激活因子p53调节细胞凋亡、衰老、DNA修复和遗传稳定性;p53通路在脑缺血损伤中起重要作用;研究表明p53通路与缺血性脑损伤密切相关,参与缺血性脑损伤的发病机制。结合以上所述的研究背景,本次研究目的:验证Cezanne在调节大脑I/R损伤中的作用,并探索了涉及SIRT6/p53通路的分子机制;Cezanne可能成为缺血性脑卒中的潜在治疗靶点。方法:第一部分:首先我们收集3例45-60岁正常人的大脑样本。通过武汉红十字会组织实施的人体捐献计划,从中南民族大学中国脑库中心（Chinese brain bank center,CBBC）获得的供者的脑组织,并且确定供者生前无神经系统疾病。这项研究需要的脑组织和医疗记录均获得了捐赠者本身及其亲属的同意,同时也获得武汉大学人民医院医学研究伦理委员会批准。3例缺血性脑卒中患者的样本通过武汉大学人民医院神经外科手术时获得的缺血的大脑皮层组织。病理诊断由3名神经病理学家独立诊断确诊。本研究使用的组织均获得了患者知情同意和武汉大学人民医院医学研究伦理委员会的批准。我们将收集到的脑组织分为正常组和实验组,蛋白免疫印迹法（Western Blotting）分析两组之间Cezanne,SIRT6和p53蛋白表达的变化。在动物实验中,我们将体重230-250克的Sprague Dawley（SD）大鼠做为实验对象,实验分为:假手术组（sham组）和MCAO/R组（Middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R组）。MCAO/R组的SD大鼠接受大脑中动脉堵塞90分钟,然后再灌注3小时,6小时,12小时,24小时后,分别取出脑组织在-20°C冰箱冰冻,sham组接受同样的麻醉和手术,但不进行大脑中动脉堵塞,随后处死大鼠,取出脑组织,在-20°C冰箱冰冻。下一步,收集MCAO/R组I/R侧的大脑皮层脑组织和sham组同样部位的脑组织进行样本的制备,Western Blotting分析两组之间Cezanne,SIRT6和p53蛋白表达的变化;同时将收集到的脑组织进行冰冻切片,然后双重免疫荧光染色分析Cezanne,SIRT6和p53在两组间蛋白表达的变化。在细胞实验中,我们将怀孕17天的SD大鼠做为实验对象,颈椎脱臼法处死大鼠,取出胚胎,在显微镜和分离液中提取大鼠皮层神经元,然后放入培养箱进行培养,每三天换一次培养液,在第12天时取出进行实验。我们将实验分为假手术组（sham组）和OGD/R组（Oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R组）。OGD/R组的大鼠原代皮层神经元在缺糖缺氧的环境中培养60分钟,然后在重新予以糖分和氧气3小时,6小时,12小时,24小时后,分别提取细胞样本。sham组接受同样的培养液,但在含有糖分的细胞外液和充足氧气培养60分钟,随后提取细胞样本。Western Blotting分析两组之间Cezanne,SIRT6和p53蛋白表达的变化。第二部分:体外培养SD大鼠的原代皮层神经元,以Cezanne si RNA（si-Cezanne）转染至皮层神经元中,转染48h后予以OGD/R（60min/24h）刺激,我们将实验分为对照组（control）,OGD/R组,OGD/R+si-NC组（OGD/R+negative control si RNA）和OGD/R+si-Cezanne组（OGD/R+si-Cezanne）,采用Western Blotting的方法检测Cezanne、凋亡指示蛋白Caspase3蛋白的变化。用LDH和MTT试验检测大鼠神经元的损伤率和生存率,流式细胞术检测加入si-Cezanne后大鼠神经元的凋亡率的改变。在SD大鼠上建造大脑缺血再灌注损伤动物模型,在MCAO/R（90min/24h）的大鼠模型中通过侧脑室注射Cezanne的慢病毒颗粒（Cezanne sh RNA,sh-Cezanne）,我们将实验分为:对照组（control）,MCAO/R组,MCAO/R+sh-Ctrl组（MCAO/R+Control sh RNA）和MCAO/R+sh-Cezanne组（MCAO/R+sh-Cezanne）,收取大鼠I/R损伤侧的半暗带脑组织（皮层脑组织）,采用Western blotting的方法检测Cezanne、Caspase3蛋白的变化。TTC染色检测加入sh-Ctrl/sh-Cezanne的大鼠在MCAO/R损伤后,脑组织梗塞面积的变化。同时在MCAO/R（90min/24h）的大鼠中通过侧脑室注射sh-Cezanne,实验分为:正常组（control）,MCAO/R组,MCAO/R+sh-Ctrl组和OGD/R+sh-Cezanne组（OGD/R+sh-Cezanne）,通过动物行为学实验:改良神经功能缺损评分试验（Modified neural function defect score,m NSS）,平衡木试验（Beam-walking）,改良贴条移除试验（Modified strip removal test,MST）检测在实验前一天,治疗后第1天,第3天,第7天,第14天动物行为学改变。第三部分:首先确定SIRT6/p53的信号通路在大鼠脑缺血再灌注模型上的作用及分子机制。在OGD/R（60min/24h）损伤的大鼠神经元模型和MCAO/R（90min/24h）损伤的大鼠模型中,我们将实验分为:正常组（control）,DMSO组（MCAO/R或OGD/R+dimethylsulfoxide）和OSS-128167组（MCAO/R或OGD/R+SIRT6的抑制剂OSS-128167）用Western Blotting方法检测SIRT6,p53蛋白水平变化。LDH和MTT实验检测各个组中OGD/R损伤的大鼠神经元的损伤率和存活率。Western Blotting检测凋亡指示蛋白Caspase3蛋白在各组内的变化。确定Cezanne/SIRT6/p53的信号通路在大鼠脑缺血再灌注模型上的分子作用机制。在OGD/R（60min/24h）损伤的大鼠神经元模型中,我们将实验分为:正常组（control）,si-NC组（OGD/R+negative control si RNA）,DMSO组（OGD/R+dimethylsulfoxide）,si-Cezanne组（OGD/R+si-Cezanne）,OSS-128167组（OGD/R+OSS-128167）和si-Cezanne+OSS-128167组（OGD/R+si-Cezanne+OSS-128167）,用Western Blotting方法检测Cezanne,SIRT6,p53蛋白水平变化。LDH和MTT实验检测各个组中OGD/R损伤的大鼠神经元的损伤率和生存率。流式细胞术检测各个组中OGD/R损伤的大鼠神经元的凋亡率的改变。结果:第一部分:（1）与正常人脑组织相比,在缺血脑组织中Cezanne的表达增高,SIRT6表达减少和p53表达增多（P＜0.05）。（2）OGD/R损伤后在大鼠原代培养神经元中Cezanne的表达增高,SIRT6表达减少和p53表达增多（P＜0.05）。（3）MCAO/R损伤后在大鼠皮层脑组织中Cezanne的表达增高,SIRT6表达减少和p53表达增多（P＜0.05）。第二部分:（1）在OGD/R+si-Cezanne组中Cezanne表达下调,Caspase3的表达下调（P＜0.05）;和OGD/R+si-NC组相比,LDH试验显示OGD/R+si-Cezanne组中细胞毒性物质LDH的释放减少（P＜0.05）,MTT试验显示细胞活力增加（P＜0.05）;流式细胞术显示在OGD/R+si-Cezanne组中神经元的凋亡率明显降低（P＜0.05）;（2）和MCAO/R+sh-Ctrl组相比,在MCAO/R+si-Cezanne组中Cezanne表达下调,Caspase3的表达下调;TTC染色显示在MCAO/R+si-Cezanne组大鼠脑组织的梗塞面积明显减少（P＜0.05）;（3）MCAO/R+si-Cezanne组的m NSS测试评分和Beam-walking行走测试评分低于MCAO/R+sh-Ctrl组（P＜0.05）,MST测试评分高于MCAO/R+sh-Ctrl组（P＜0.05）。第三部分:（1）和DMSO组相比,在OSS-128167组中SIRT6表达下调,p53表达上调,Caspase3的表达上调（P＜0.05）;LDH实验显示细胞毒性物质释放增多（P＜0.05）,MTT实验显示细胞存活率降低（P＜0.05）;（2）和si-NC组相比,在si-Cezanne组中Cezanne表达下调,SIRT6表达上调,p53表达下调（P＜0.05）;和DMSO组相比,在OSS-128167组中Cezanne表达基本无变化,SIRT6表达下调,p53表达上调（P＜0.05）;和si-Cezanne组相比,在si-Cezanne+OSS-128167组中LDH实验显示细胞毒性物质释放增加（P＜0.05）,MTT实验显示细胞存活率降低（P＜0.05）,流式细胞术显示细胞凋亡率增加（P＜0.05）。结论:本研究首次发现抑制Cezanne在I/R损伤中发挥神经保护作用,并发现抑制Cezanne提高I/R损伤后神经元存活率的新信号通路。抑制Cezanne通过上调SIRT6从而降低p53的表达水平,最终起到神经保护作用。Cezanne可能成为治疗脑损伤的新靶点。