1993年,Ash等对芽胞杆菌属(Bacillus)的rRNAGroup3的分类地位进行了重新评价后,建立了新属——类芽胞杆菌属(Paenibacills),隶属于芽胞杆菌目类芽胞杆菌科。目前该属成员有244种,其基本特征为:细胞呈杆状,革兰氏染色阳性、阴性或可变,以周生鞭毛运动,能形成芽胞。该属的许多成员与植物关系密切,具有固氮、促长、病害防治等作用,在农业领域有广阔的应用前景。基因组学已成为微生物学领域的热门研究方向,本课题组已经在类芽胞杆菌属的基因组学方面开展了一些工作,但尚未开展该属的比较基因组学研究。因此,本文在分析完成测序的50种类芽胞杆菌(截至2016年3月)的基因组基本信息的基础上,从基因组组分、基因功能、物质转运、碳代谢、信号转导系统、基因表达调控等方面进行比较基因组学分析,并开展了基于全基因组的类芽胞杆菌属的系统发育、进化和分类学研究。现将初步研究结果总结如下。1、50个已知种类的基因组基本信息分析首先,每个基因组都给出以下信息:物种的最早发现者、测序菌株是否为模式菌株及其来源、16s rRNA序列登录号、基因组序列登录号、测序平台和提交机构。然后,通过软件包预测各基因组的重复序列、编码基因、非编码RNA、假基因、基因岛、CRISPR、前噬菌体、分泌蛋白与跨膜蛋白。最后,根据这些信息,分别绘制各基因组的圈图。2、50个已知种类的比较基因组学分析基因组组分方面:(1)类芽胞杆菌基因组存在2大类重复序列:散在重复序列和串联重复序列。其中,散在重复序列的LINE和SINE占优势,DNA转座子次之,LTR是稀有类型;串联重复序列含小卫星DNA、微卫星DNA和低复杂度序列,而且,在各基因组中微卫星DNA呈现明显的扩张现象。(2)编码基因数量为2921-8865个;假基因数量为0-66个;基因岛数量为2-23个,总长度为10067 bp-459155 bp;分泌蛋白数量在44-382个,跨膜蛋白数量在718-2134个。(3)非编码RNA:rRNA的拷贝数差异较大;tRNA数量在30-104个之间;sRNA数量有的多达29个,有的少于10个,8个基因组未预测到sRNA。(4)前噬菌体相关序列的数量在5-318个。(5)CRISPR/Cas相关序列数量在7-304个,涉及Casl-8和Casl0相关蛋白,16个基因组中未预测到Cas相关蛋白,但存在CRISPR组分。所有基因组中均未发现Cas9蛋白,说明类芽胞杆菌中的CRISPR/Cas系统属于I型和III型。上述结果表明,50个类芽胞杆菌基因组的组分存在显著差异,特别是编码基因数量,可能的原因是:1)在进化过程中,各基因组发生了明显不同的基因的获得和丢失;2)基因组的测序覆盖度、组装完整性和预测准确性造成的差异。基因功能方面:(1)根据COG聚类分析结果,类芽胞杆菌的编码基因可以划分为22个功能类群。(2)KEGG通路分析结果显示,ABC转运系统、双组份系统、氨基酸合成和碳代谢的成员数量最多。其中,ABC转运系统可分8个家族;PTS系统可分6个家族;双组分系统分为10个家族。(3)50个类芽胞杆菌基因组中均存在糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环的完整代谢途径相关基因,10个基因组中含合成PHB的全部酶类。(4)除了树形类芽胞杆菌(P.dendritiformis)基因组中未发现cheA与cheY基因外,其他基因组具有完整的趋化系统,这也提示:树形类芽胞杆菌不能形成鞭毛。(5)类芽胞杆菌中存在c-di-AMP和c-di-GMP第二信使信号转导系统,15个基因组的c-di-AMP合成酶DisA只含DisA_N结构域,其他基因组中的DisA均含DisA_N和DisA_linker结构域。c-di-GMP的降解酶——含EAL结构域的磷酸二酯酶(拷贝数为1-6个)均存在;37个基因组中含GGDEF/EAL结构域的双功能基因(拷贝数为1-12个);4个基因组还存在1-2个含GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶。(6)芽胞形成的调控:50个基因组均存在芽胞特异性σ因子和SpoOA磷酸化接力相关基因,但各基因的拷贝数存在差异。3、基于全基因组的类芽胞杆菌属的系统发育、进化与分类初步研究(1)类芽胞杆菌属的系统发育与进化:分别构建了基于全基因组单拷贝基因和基于16srRNA基因的50个已知种类的系统发育进化树,结果显示,这50个已知种被归类到8个进化枝,而且,2种进化树中的大部分进化枝的成员保持一致,少数进化枝出现变动。基于全基因组单拷贝基因的进化树不仅重构了类芽胞杆菌的进化与亲缘关系,还提示了类芽胞杆菌为单系起源。共线性分析进一步显示,许多种类之间的亲缘关系密切。基因家族聚类分析结果表明,50个类芽胞杆菌基因组中的种特异的基因家族数量均未超过9%,提示:类芽胞杆菌中的绝大多数基因家族在进化上的保守性;编码基因数量差异的主要动力是不同基因家族在不同基因组中的复制与扩增程度。(2)类芽胞杆菌属50个已知种的分类地位评价:首先,分别计算50个已知种基因组两两之间的ANI和eDDH值;然后,根据ANI和eDDH值对50个已知种的分类地位进行评价,结果显示,苦苣菜类芽胞杆菌(P.sonchi)与里奥格兰德类芽胞杆菌(P.riograndensis)的ANI和eDDH值均超过定种阈值,可以确定它们是同种异名,应重新进行分类。另外,皮尔瑞俄类芽胞杆菌(P.peoriae)与多黏类芽胞杆菌(P.lymyxP.的ANI值为96.23%,超过闽值,而eDDH值也达到69%,非常接近菩值。因此,它们的分类地位有待于进一步的评价。(3)61个未定种(Paenibacillus sp.)菌株的分类地位评价:首先,分别下载GenBank中的61个未定种菌株的基因组序列,并分别计算111个基因组两两之间的ANI和eDDH值;然后,对61个未定种的菌株的分类地位进行评价,结果表明:有16个菌株与亲缘关系最近的菌株两两之间的eDDH值大于70%,超过其阈值,应归为同一种,其中,有3个匹配到已知种;有28个菌株与亲缘关系最近的菌株两两之间的AN1值大于96%,超过其阈值,其中,有5个匹配到已知种。综合这些分析结果,完成基因组测序的61个未定种菌株可确定为类芽胞杆菌属的35-40独立种;ANI和eDDH值均超过阈值,而且二者匹配到同一个已知种的菌株为J14、JCM16163和FSLH8-237,因此,可以确定它们分别是巴伦氏类芽胞杆菌(P.odorifer)、食蔡类芽胞杆菌(P.naphthalenovorans)和载味类芽胞杆菌(P.barengoltzii)的1个菌株。