胆汁淤积症是肝脏疾病最常见的临床症状之一,目前治疗胆汁淤积的药物较为缺乏。组成型雄甾烷受体（Constitutive androsterane receptor,CAR）是肝脏胆红素合成及转运的重要调节因子,在胆汁淤积及黄疸的发病中发挥重要作用,因而成为治疗胆汁淤积的潜在药物靶点。本研究以CAR为靶点,以中药单体化合物为研究对象,基于计算机辅助药物发现结合宏观实验学技术,采用“in silico→in vitro→in vivo”层层递进的虚拟筛选评价策略来寻找安全有效且具有“退黄”功效的新型天然化合物。方法（1）基于分子对接方法的虚拟筛选技术发现对hCAR具有激动活性的潜在天然化合物分子人源CAR（hCAR）晶体结构来源于PDB数据库（PDB code:1XVP）,化合物分子来源于中药单体数据库（TCM Database）和天然产物库（DNP Natural product）,对蛋白和化合物分子结构进行预处理。晶体结构中配体小分子CITCO位置用来定义对接的格点位置,将已知激动剂分子CICTO对接到hCAR的活性位点中,以验证对接方法的可靠性。然后采用层层递进的虚拟筛选策略,即HTVS→SP→XP的精度,每步均选取打分值排名前10%的分子;最后对筛选出的小分子进行ADME/Tox性质预测,确定与hCAR结合较好的天然化合物分子,作为候选化合物进行下一步实验。（2）体外细胞水平考察候选化合物的毒性和对hCAR的激活活性采用MTT实验考察候选化合物在体外细胞水平上24 h和72 h的细胞毒性。基于构建的hCAR1过表达质粒、CYP2B6荧光素酶报告基因质粒、海肾对照质粒,转染至Hep G2细胞,获得Hep G2-CYP2B6-hCAR1细胞。转染后的细胞中依次加入10、20、40、80和100μmol/L的化合物,5μmol/L的PK11195,1μmol/L的阳性药物CITCO以及对照（DMSO）进行干预,最后检测荧光素酶活性,考察购买得到的化合物对hCAR的激活活性。（3）探究目标化合物对ANIT诱导的胆汁淤积模型小鼠的影响雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、阳性药OCA组、阳性药TCPOBOP组、化合物#004（L）（1 mg/kg）、#004（M）（5 mg/kg）、#004（H）（10 mg/kg）、#006（L）（1 mg/kg）、#006（M）（5 mg/kg）、#006（H）（10mg/kg）、#014（L）（1 mg/kg）、#014（M）（5 mg/kg）和#014（H）（10 mg/kg）,每组八只。实验周期为一周,在第五天时实验组小鼠给予溶于橄榄油的ANIT（75mg/kg）。最后一天给药2小时后,收集血液和肝脏组织。分别对ALT、AST、TBA、TBIL、DBIL、TC、TG和总胆汁酸进行检测。Q-PCR技术测定小鼠肝脏组织Car、Cyp2b6、Ugt1a1、Ntcp和Mrp2 m RNA转录水平的变化。用苏木素-伊红染色（HE染色）检测肝组织病理改变。（4）体外细胞水平考察候选化合物对胆红素水平的影响利用高胆红素细胞模型,在10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和100μmol/L的目标化合物干预后,通过检测生化指标TBIL和DBIL,评价目标化合物的“退黄”作用。最后采用Q-PCR法检测高胆红素Hep G2细胞CAR,CYP2B6和胆红素代谢酶m RNA的变化水平。结果（1）基于分子对接技术筛选对hCAR具有激动活性的天然小分子化合物:对接方法的验证结果显示对接得到的构象与复合物晶体结构中的构象的RMSD值为0.224?,说明Glide对接方法可以很好的重现激动剂分子与hCAR的结合模式。依次采用HTVS→SP→XP精度将化合物库中的分子对接到hCAR的活性口袋中,将对接后的构象与hCAR-CITCO结合模式相比较,保留结合模式和对接打分较优的前20种化合物。以代表性化合物#006和#014为例,分析了#006-hCAR复合体、#014-hCAR复合物和CITCO-hCAR复合结构形成的疏水作用力碱基是相同的,说明化合物#006、#014和CITCO都结合在hCAR的相同疏水口袋位置中。（2）体外细胞水平考察候选化合物的毒性和对hCAR的激活活性:对购买获得的18个化合物进行MTT实验,结果显示化合物#012在浓度0～100μmol/L干预Hep G2细胞24 h后,细胞存活率降低（P＜0.05）,其IC50计算值为82.1±2.27μmol/L,说明#012具有细胞毒性,因此在荧光素酶报告基因实验中被排除;其余候选化合物干预Hep G2细胞24 h后,存活率无明显变化。荧光素酶活性结果显示17个候选化合物分子中#006被认为是hCAR的强激动剂,其活性超过CITCO介导的激活活性的40%,达到最大激活值42.7%;化合物#004和#014被定义为中度hCAR激活剂,为CITCO介导hCAR激活活性的15%～40%,达到最大激活值34.1%和31.7%。因此将化合物#004,#006和#014作为目标化合物进行后续体内实验验证。（3）探究目标化合物对ANIT诱导的胆汁淤积模型小鼠的影响:体重变化结果显示在第5天到第7天,模型组小鼠体重显著降低,在TCPOBOP、OCA、化合物#004（L、M、H）、化合物#006（L、M、H）和化合物#014（L、M）干预后小鼠体重并无明显变化;与模型组小鼠体重相比,化合物#014（H）干预后小鼠体重增加（P＞0.05）。血清学结果显示模型组小鼠肝功能相关酶活性和TBIL、TBA水平明显升高（P＜0.001）;与模型组相比,阳性药组（OCA和TCPOBOP）,肝脏酶活性和TBIL、TBA水平显著降低（P＜0.001）。与模型组相比,目标化合物#004和#014的三个剂量组（L、M、H）和#006的高剂量组（H）小鼠的肝功能相关酶活性和TBIL、TBA水平显著降低（P＜0.001）。肝脏组织病理学结果显示与正常组相比,模型组的肝组织中有较多炎症细胞浸润,肝细胞大小不均,排列紊乱。给予阳性药后肝细胞大小均一,细胞核清晰可见;在#004（H）、#006（H）和#014（H）干预后,小鼠的肝细胞大小一致,形态和结构均接近正常组,呈放射状排列整齐。Q-PCR实验结果显示与正常组相比,模型组小鼠肝组织中Oatp1b2 m RNA转录水平明显升高（P＜0.01）,Mrp2、Ugt1a1、Ntcp和Sult2a1 m RNA转录水平明显降低（P＜0.01）。阳性药OCA和TCPOBOP组,基因Sult2a1、Ntcp、Ugt1a1和Mrp2基因转录水平明显增加（P＜0.01）,基因Oatp1b2转录水平明显降低（P＜0.01）。化合物#004（L、M、H）小鼠的肝组织Sult2a1、Ntcp、Ugt1a1和Mrp2基因转录水平显著增加（P＜0.01）,而基因Oatp1b2转录水平降低（P＜0.05）,均有统计学差异;化合物#006（M、H）干预后肝组织Sult2a1、Ntcp、Ugt1a1和Mrp2基因转录水平增加（P＜0.05）,而基因Oatp1b2转录水平降低（P＜0.05）,变化均有统计学意义;化合物#014（L、M、H）小鼠的的肝组织Sult2a1、Ntcp、Ugt1a1和Mrp2基因转录水平显著增加（P＜0.05）,而基因Oatp1b2转录水平明显降低（P＜0.05）。（4）体外细胞水平考察目标化合物对胆红素水平的影响:细胞内胆红素测定结果显示模型组细胞内TBIL和DBIL水平显著升高（P＜0.05）;与模型组比较,目标化合物#004、#006和#014的给药浓度为20μmol/L时,均能显著降低细胞内TBIL和DBIL含量。在浓度为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和100μmol/L时能明显降低TBIL水平,具有显著性差异（P＜0.05）,且呈剂量依赖性。Q-PCR实验结果显示阳性药CITCO能明显诱导UGT1A1、CYP3A4和CYP2C9基因的表达（P＜0.01）。化合物#004,#006和#014在干预Hep G2细胞后UGT1A1基因的表达均明显升高,与模型组相比均有显著性差异（P＜0.01）。结论（1）通过基于分子对接方法的虚拟筛选技术,以CAR为靶点,从中药单体和天然化合物库中发现了潜在激活hCAR的化合物。（2）将筛选得到的小分子在Hep G2细胞中考察活性和毒性,发现化合物#004、#006和#014对hCAR激活活性较强,实验结果表明这3个化合物为hCAR的潜在高效激动剂。（3）通过肝内胆汁淤积小鼠模型评价了候选化合物#004,#006和#014的药效学。实验结果表明候选化合物能明显改善小鼠的血清学指标和病理学,化合物#004、#006和#014干预后小鼠肝脏组织的胆红素重吸收转运体基因转录水平降低,但代谢和外排相关基因转录水平增加,说明这3个化合物可缓解胆汁淤积。（4）采用高胆红素细胞模型进一步探究3个化合物作为hCAR潜在激动剂调控胆红素水平的机制。结果显示:化合物#004,#006和#014干预组在降低模型胆红素水平方面疗效较显著,且无细胞毒性;通过Q-PCR实验结果显示候选化合物可能增加胆红素代谢基因的表达,从而减少胆红素在细胞内的蓄积。