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花青素是形成草莓果实颜色的主要色素。花青素亦称花色素,为黄酮类多酚化合物。深受市场欢迎的草莓果实中含有大量黄酮类物质,它决定被子植物花、果实、种皮、茎叶和根等器官的颜色,另外,作为天然色素和抗衰老添加剂应用到食品染色、化妆品、保健品等方面。草莓是世界七大水果之一,被誉为“水果皇后”,具有重要的营养价值、药用价值和经济价值。草莓已经被证明具有高抗氧化活性,这一活性与果实内的多酚化合物的含量有关,尤其是花青素,它是成熟草莓果实中酚类物质的重要组成成分。所以,阐明草莓果实花青素积累的分子机理对草莓的生产至关重要。本文以红颜草莓果实为试材,根据前期转录组和代谢组的整合分析结果,克隆得到两个GSTs基因,命名为FaGST173和FaGST660。本论文对两个GSTs基因进行生物信息学分析和功能验证,采用实时定量PCR技术,对FaGST1 73和FaGST660进行表达模式分析。构建过量表达载体pBI121-FaGST173和pBI121-FaGST660,并成功转化拟南芥Col-O,并鉴定得到若干转基因植株;构建干涉表达载体pHellsgate2-FaGST173和TRV2-FaGST660,并注射草莓果实进行功能验证研究;构建GFP融合蛋白pRI101-GFP-FaGST173和pRI101-GFP-FaGST660,对基因进行亚细胞定位。通过以上试验验证GSTs基因在花青素合成转运过程中的分子机理。本试验取得以下主要结果:1、以红颜草莓果实为试材,克隆得到两个GST基因FaGST173和FaGST660。系统进化树结果表明:FaGST1 73、FaGST660与ZmBz2同源性最高,同时也与已经发表过的具有花青素转运花功能的AtTT19、PhAN9也具有较高的同源性;通过该蛋白序列比对的结果可以看出FaGST173/FaGST660与ZmBz2同源性达到57.36%,推测FaGST1 73/FaGST660参与花青素转运过程。2、实时定量PCR对FaGST173和FaGST660基因进行时空表达模式分析,发现FaGST1 73基因在花中相对表达量最高,幼叶次之,在果实中表达量最低。在草莓六个不同发育时期果实表达分析结果表明,FaGST173转色期表达显著上调,红果期表达量最高,成熟期又略有下调,表明此基因可能与花青素积累有关。发现FaGST660基因在匍匐茎中相对表达量最高,其他部位表达量相对较低。在草莓六个不同发育时期果实表达分析结果表明,FaGST660红果期表达显著上调,表明此基因可能与花青素积累相关。3、草莓六个不同发育期果实GST酶活测定结果表明,其在绿白期、转色期酶活性较高整体趋势是先升高后下降,与FaGST173和FaGST660基因基因表达和花青素积累模式相似,表明FaGST1 73和FaGST660可能与花青素转运相关关。花青素功能基因表达模式分析表明,CHS1/3、F3H1、DFR2、ANS1和UFGT1基因表达与花青素积累相关性较高,在花青素的生物合成途径中发挥关键作。4、红颜草莓及其白肉突变体小白中FaGST1 73和FaGST660基因表达模式分析,FaGST1 73基因表达量在草莓红颜果肉、果皮中高于小白,与花青素含量模式一致;但是FaGST660基因表达量在红颜草莓果肉中却低于小白,说明FaGST1 73基因在草莓果实花青素积累过程中起到关键的作用。同时检测了红颜和小白果肉和果品中花青素合成、调控相关基因的表达模式,发现ANS1和UFGT1在红颜果皮中的表达量显著高于小白,而花青素调控基因中只有bHLH3中在红颜果皮的表达量高于小白,说明这些基因是草莓果实花青素积累的关键合成和调控基因。5、FaGST1 73和FaGST660基因对ABA处理的响应模式:结果发现对照组组培苗中花青素在积累非常少,ABA处理可以明显促进花青素的积累,且花青素含量与处理浓度呈正相关性,ABA浓度为50 mg L-1时花青素含量为45 mLg-1,至浓度100mg L-1花青素含量为74 mLg-1;FaGST1 73和FaGST660基因的表达也受到ABA处理的诱导,与对照相比,其表达量在ABA浓度100 mg L-1时增加了200倍,而FaGST660在浓度100 mg L-1时表达量却是降低的;6、亚细胞定位:为了确定FaGST173和FaGST660基因亚细胞定位,构建了 FaGST1 73-GFP和FaGST660-GFP融合表达载体,注射法转化本氏烟草表皮,结果表明FaGST1 73和FaGST660均定位于质膜。7、FaGST1 73蛋白酶活测定:构建pMAL-C5X-FaGST173原核表达载体,诱导并纯化该蛋白,进行酶活测定,发现该蛋白具有GST转运蛋白酶活性,且蛋白活性最适温度在25-30℃之间。8、遗传转化、基因功能验证:构建了植物过量表达载体PBI121-FaGST173和PBI121-FaGST660,并成功转化异源植物拟南芥,最终得到转基因苗若干个。构建了植物干涉载体pHellsgate2-FaGST173和TRV2-FaGST660,并成功注射八倍体草莓果实,发现FaGST1 73在草莓果实着色过程中起到关键作用。RT-PCR结果发现,FaGST1 73基因在注射区域被明显抑制,花青素积累减少了 78%另外,花青素合成基因CHS1/3、F3H1、DFR2、ANS1和UGT1和调控基因MYB10的表达也受到明显抑制。