糖尿病肾病（Diabeticnephropathy,DN）是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,是患者进展为终末期肾病（End-stage renal disease,ESRD）的主要危险因素,糖尿病（Diabetesmellitus,DM）患者进展为ESRD的患病率高出正常人十倍。进行性蛋白尿是糖尿病肾病最早的临床特征之一。DN患者肾小球足细胞损伤与蛋白尿和肾小球硬化密切相关。大量研究表明炎症介质浸润、晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）积累、自噬和凋亡等多种途径均参与了 DN患者的足细胞损伤过程。然而,DN的具体发病机制目前尚未完全阐明。在临床上,严格的血糖控制是预防和治疗DN的关键措施。然而,多个临床研究在长期随访过程中发现,尽管早期强化血糖控制,仍有大约三分之一的DM患者会最终进展至DN阶段。造成该现象的原因涉及一系列糖尿病并发症相关的致病因素,包括AGEs、氧化应激、炎症和表观遗传修饰等。表观遗传修饰是指在没有细胞核DNA序列改变的情况下,基因功能发生可逆的、可遗传的改变,包括甲基化调控、组蛋白修饰、非编码RNA及染色质重塑等。由于营养状况等多种环境因素可以影响糖尿病和糖尿病肾病的进展,这一过程反过来会改变表观遗传状态,因此表观遗传修饰可能在糖尿病肾病的发病机理中发挥关键作用。作为表观遗传修饰的重要方式之一,长链非编码RNA（Long-noncoding RNA,lncRNA）在DM和DN的发病机制中发挥着重要作用。本团队前期利用肾脏病特色生物样本库,通过高通量芯片Arraystar人类LncRNA芯片V3.0分别对经肾穿刺活检证实的DN患者血、尿、肾组织标本进行筛选,并与正常对照组进行比较,发现 lncRNA（Distal-less homeobox 6 antisense 1,DLX6-AS1,与小鼠Dlx6os1直系同源）在DN患者体内的表达水平较正常对照组明显增多。我们的前期研究还发现DLX6-AS1表达与DN患者蛋白尿排泄增多呈正相关。此外,在链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的Ⅰ型DM和db/db小鼠模型中,足细胞特异性Dlx6os1缺失在减轻足细胞炎症反应及延缓肾脏损伤中发挥至关重要的作用。然而,DN中DLX6-AS1表达升高的调控因素仍不清楚。因此,在本课题中,我们体外培养永生化人源及小鼠源足细胞,利用DNA-pull down联合液相色谱-串联质谱技术以及JASPAR数据库筛选DLX6-AS1/Dlx6os1潜在转录调节因子,筛选出转录因子cAMP反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）在 DN 中高表达且与DLX6-AS1/Dlx6os1的基因序列存在结合。CREB是一种分子量大小为43kDa的转录诱导因子,在多种肿瘤及肝脏糖异生过程中被证实可以通过调控lncRNAs的表达参与疾病的发生发展过程。然而,在糖尿病肾病足细胞损伤过程中CREB与DLX6-AS1的表达之间是否存在相关性仍未见报道。在本课题中,我们通过双荧光素酶报告基因检测和染色质免疫共沉淀的方法验证CREB与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子区域是否结合。通过体内和体外实验研究其在肾脏足细胞损伤中的作用及机制,并在糖尿病db/db模型小鼠和体外培养的人足细胞中通过基因干预及666-15靶向抑制调控CREB的表达进而探索其通过DLX6-AS1/Dlx6os1参与DN炎症反应及足细胞损伤的作用机制。第一部分:转录因子CREB对DLX6-AS1/Dlx6os1表达及肾脏足细胞损伤的影响目的筛选DN状态下DLX6-AS1/Dlx6os1升高的潜在转录调节因子;在db/m对照小鼠足细胞中过表达CREB的表达,观察其在Dlx6os1升高及小鼠足细胞损伤中的作用;并在体外培养的人源足细胞中探究CREB在足细胞损伤中的作用机制。方法1.体外高糖培养人源及小鼠源永生化足细胞,通过DNA-pull down联合液相色谱-串联质谱技术筛选DLX6-AS1/Dlx6os1基因序列上结合的蛋白;并通过JASPAR数据库进一步筛选与DLX6-AS1结合的潜在转录因子。2.在DN患者及db/db模型小鼠肾组织标本和高糖培养的足细胞中进一步验证与DLX6-AS1/Dlx6os1结合的潜在转录因子。3.通过RNA荧光原位杂交、双荧光素酶报告基因检测及染色质免疫共沉淀的方法验证转录因子CREB与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子序列是否结合及结合位点序列。4.将10周龄db/m小鼠随机分为对照组（db/m组）、注射对照病毒组（db/m+Vehicle组）及转染特异性足细胞过表达CREB腺相关病毒组（db/m+CREB-OE组）,根据实验分组分别于基线时、注射后4周及12周各处死一批小鼠,留取组织备用。检测血糖、肾重体重比（Kidneyweight/bodyweight ratio,KW/BW）及尿白蛋白肌酐比（Urinary albumin creatinine ratio,uACR）等生化指标。采用PAS染色及电镜观察各组小鼠肾脏病理改变。5.采用免疫荧光染色检测WT-1与Flag共定位情况。免疫荧光染色及Western blot 检测足细胞标记蛋白（nephrin、podocin、synaptopodin）、损伤指标（desmin）以及炎症蛋白（B7-1）的表达。采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）、RNA荧光原位杂交联合免疫荧光染色检测各组小鼠足细胞中Dlx6os1的表达。6.体外培养人源足细胞,分为NG组、NG+对照病毒组（NG+Vehicle）、NG+CREB过表达腺病毒组（NG+CREB OE组）、NG+CREB过表达腺病毒+DLX6-AS1干扰慢病毒组（NG+CREB OE+DLX6-AS1 KD）,采用qPCR、RNA荧光原位杂交联合免疫荧光染色检测各组细胞中DLX6-AS1、CREB mRNA表达水平。7.采用Western blot及免疫荧光染色检测各组细胞中CREB、pCREB、足细胞标记蛋白、损伤指标及细胞骨架蛋白的表达。结果1.在高糖培养的人源及小鼠源足细胞中,DNA-pull down联合质谱分析分别筛选出2756、2664种蛋白与DLX6-AS1/Dlx6os1基因序列结合;JASPAR数据库分别预测出131、73种转录因子与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子序列结合。其中,糖尿病肾病状态下,转录因子CREB表达水平及活性较对照组明显升高（P＜0.05）,其可以通过与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子序列结合发挥转录调节作用。2.小鼠足细胞中CREB过表达腺相关病毒转染效率约为60%,转染效果较好且于注射12周后保持稳定。特异性过表达CREB 12周后,小鼠uACR值明显高于对照组（db/m组和db/m+Vehicle组）（P＜0.05）,但血糖值及KW/BW值差异无统计学意义（P＞0.05）。PAS染色及电镜结果显示,与对照组小鼠相比,db/m+CREB-OE组肾小球基底膜明显增厚,足细胞足突广泛融合、消失,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.与对照组小鼠相比,db/m+CREB-OE组足细胞标记蛋白表达减少,损伤蛋白desmin及炎症相关蛋白B7-1表达增多,足细胞损伤程度加重。此外,Dlx6os1表达水平明显高于对照组（P＜0.05）。4.在体外培养的足细胞中,NG+CREB OE组DLX6-AS1的表达水平、CREB的表达及活性较NG+Vehicle组增多（P＜0.05）。NG+CREB OE+DLX6-AS1 KD组DLX6-AS1的表达较NG+CREBOE组减少（P＜0.05）,而CREB表达及活性未发生明显改变。5.与NG+Vehicle组相比,NG+CREB OE组足细胞标记蛋白表达减少,损伤蛋白表达增加;而NG+CREB OE+DLX6-AS1 KD组逆转了这一改变。结论1.糖尿病肾病状态下,转录因子CREB可以通过与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子序列结合上调其表达。2.过表达CREB可以通过上调DLX6-AS1/Dlx6os1的表达显著增加db/m小鼠尿白蛋白排泄,导致足细胞炎症反应及肾脏损伤。第二部分:足细胞特异性敲低CREB对DLX6-AS1/Dlx6os1表达及糖尿病肾病足细胞损伤的影响目的在高糖培养的足细胞中下调CREB,观察DLX6-AS1的表达情况,并检测其是否发挥足细胞保护作用;在糖尿病db/db模型小鼠中,观察足细胞特异性敲低CREB是否对Dlx6os1有调控作用,以及是否可以缓解小鼠肾脏损伤和尿蛋白排泄。方法1.在高糖培养的足细胞中分别加入对照病毒及三条CREB干扰腺病毒,采用qPCR及Western blot筛选干扰效果最好的shRNA序列。采用qPCR及RNA荧光原位杂交检测转染CREB干扰腺病毒后DLX6-AS1的表达水平。采用Western blot、免疫荧光染色检测足细胞标记蛋白、损伤指标及细胞骨架蛋白的表达情况,观察转染CREB干扰腺病毒后高糖培养足细胞中炎症反应及损伤情况的改变。2.将10周龄db/db小鼠随机分为对照组（db/db组）、注射对照病毒组（db/db+Vehicle组）及转染足细胞特异性CREB敲低腺相关病毒组（db/db+CREB-KD组）,对血糖、KW/BW及uACR等生化指标进行检测。根据实验需求分别于基线水平、注射后4周及12周分批处死小鼠,取肾组织备用。采用PAS染色及电镜观察各组小鼠肾脏病理改变。3.在db/db小鼠中,采用免疫荧光染色、免疫组化染色及Western blot实验检测足细胞特异性CREB敲低腺相关病毒的转染效果。4.采用qPCR、RNA荧光原位杂交联合免疫荧光染色检测各组小鼠足细胞中Dlx6os1的表达。5采用免疫荧光染色及Western blot检测足细胞标记蛋白（nephrin、podocin、synaptopodin）、损伤指标（desmin）以及炎症蛋白（B7-1）的表达。结果1.qPCR及Western blot实验结果显示,高糖培养的足细胞中转染三条CREB干扰腺病毒均具有干扰效果,且sh3效果最明显。2.与HG+Vehicle组相比,HG+CREB-KD组DLX6-AS1表达水平明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。且HG+CREB-KD组足细胞标记蛋白表达增多,损伤蛋白表达较少,细胞骨架蛋白F-actin表达量增加,细胞完整性破坏程度减轻。3.与对照组（db/db 组、db/db+Vehicle 组）小鼠相比,db/db+CREB-KD4 周及12周组小鼠uACR值显著降低（P＜0.05）,但血糖值与KW/BW值差异无统计学意义（P＞0.05）。db/db+CREB-KD 4周及12周组CREB、pCREB表达水平亦明显下降（P＜0.05）。4.PAS染色及电镜结果显示,与对照组小鼠相比,db/db+CREB-KD组系膜基质增生减轻,基底膜增厚明显缓解,足突融合消失,差异有统计学意义（P＜0.05）。5.与对照组小鼠相比,db/db+CREB-KD组小鼠肾脏足细胞中Dlx6os1表达明显降低（P＜0.05）。db/db+CREB-KD组小鼠足细胞中足细胞标记蛋白的表达量增加,而损伤蛋白desmin和炎症指标B7-1的表达量降低。结论1.在高糖培养的足细胞中,敲低CREB可以下调DLX6-AS1的表达,并缓解足细胞炎症反应及细胞损伤。2.在db/db模型小鼠中,足细胞特异性敲低CREB可以降低肾脏足细胞中Dlx6os1的表达,减少尿蛋白排泄,缓解肾脏足细胞损伤及炎症反应。第三部分:666-15靶向抑制CREB对DLX6-AS1/Dlx6os1表达及糖尿病肾病足细胞损伤的影响目的用CREB特异性抑制剂666-15处理高糖培养的足细胞及糖尿病db/db模型小鼠,检测足细胞中DLX6-AS1/Dlx6os1表达有无下降,以及是否减轻足细胞损伤及炎症反应;在给予666-15处理的db/db小鼠中特异性过表达足细胞中Dlx6os1的表达,观察666-15的缓解作用是否被抵消。方法1.在高糖培养的人源足细胞中,分别加入浓度为0.25、0.5、1μM的666-15溶液,采用Western blot检测各组细胞中CREB、pCREB、足细胞标记蛋白、损伤蛋白desmin、炎症指标B7-1的表达水平,并采用qPCR检测DLX6-AS1的表达变化。2.将10周龄db/db小鼠随机分为对照组（db/db组）、注射溶剂组（db/db+Saline 组）、腹腔注射 666-15 组（db/db+666-15 组）及腹腔注射 666-15+尾静脉注射足细胞特异性过表达Dlx6os1慢病毒组（db/db+666-15+Dlx6os1 OE组）定期检测一般情况、血糖、体重及uACR。根据实验需求分别于基线水平、连续注射3周及7周时分批处死小鼠,取肾组织备用。PAS染色及电镜观察各组小鼠肾脏病理改变。3.采用qPCR及RNA荧光原位杂交检测各组小鼠足细胞中Dlx6os1的表达。4.采用免疫荧光染色及Western blot检测各组小鼠肾脏足细胞标记蛋白（nephrin、podocin、synaptopodin、WT-1）、损伤指标（desmin）以及炎症蛋白（B7-1）的表达。结果1.在高糖培养的足细胞中加入不同浓度的666-15溶液,CREB、pCREB、DLX6-AS1的表达水平随浓度的增加而下降（P＜0.05）。2.与对照组相比,在高糖培养的足细胞中加入666-15可以增加足细胞标记蛋白nephrin、podocin的表达水平,降低B7-1及desmin的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.与对照组（db/db组及db/db+Saline组）小鼠相比,db/db+666-15组小鼠uACR值明显下降（P＜0.05）,但血糖与肾重体重比值无显著差异（P＞0.05）;而db/db+666-15+Dlx6os1 OE 组 uACR 值明显高于 db/db+666-15 组（P＜0.05）。4.PAS染色及电镜结果显示,与对照组小鼠相比,db/db+666-15组表现为系膜基质增生减轻,基底膜增厚明显缓解,足突融合消失,差异有统计学意义（P＜0.05）;但db/db+666-15+Dlx6os1 OE组明显抵消了 666-15的肾脏损伤缓解作用。5.db/db+666-15组小鼠肾脏Dlx6os1表达水平明显低于对照组小鼠,差异有统计学意义（P＜0.05）;而db/db+666-15+Dlx6os1 OE组小鼠肾脏Dlx6os1表达水平较db/db+666-15组明显升高（P＜0.05）。6.免疫荧光染色及Western blot检测结果显示,db/db+666-15组小鼠肾脏足细胞中足细胞标记蛋白的表达水平明显高于对照组,而损伤蛋白desmin和炎症指标B7-1的表达量降低。而与db/db+666-15组相比,db/db+666-15+Dlx6os1 OE组nephrin表达减少,B7-1表达增加,但CREB的表达及活性并未见明显差异。结论1.在体外培养的足细胞中,CREB特异性抑制剂666-15以剂量依赖的方式下调DLX6-AS1表达,继而缓解高糖引起的足细胞损伤。2.在db/db模型小鼠中,腹腔注射666-15可以减少肾脏足细胞中Dlx6os1表达,减轻肾脏足细胞炎症反应并缓解肾脏损伤;而足细胞特异性过表达Dlx6os1可以一定程度上抵消666-15的肾脏保护作用。全文结论:1.糖尿病肾病状态下,转录因子CREB通过与DLX6-AS1/Dlx6os1启动子序列结合上调其表达。2.过表达CREB通过上调DLX6-AS1/Dlx6os1的表达显著增加db/m小鼠尿白蛋白排泄,导致足细胞炎症反应及肾脏损伤。3.足细胞特异性敲低CREB或666-15靶向抑制CREB可以下调DLX6-AS1/Dlx6os1的表达,缓解糖尿病肾病足细胞损伤。4.足细胞特异性过表达Dlx6os1可以一定程度上抵消666-15的肾脏保护作用。