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目的:本课题通过探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）-AT1R-瞬时受体电位阳离子通道6（TRPC6）途径在肾病综合征中的作用及当归芍药散的干预作用,阐明肾病综合征足细胞损伤分子机制及当归芍药散的治疗作用,为探讨肾病综合征发生机制及当归芍药散的临床应用提供实验依据。方法:第一部分肾病综合征大鼠模型的建立及AngⅡ、TRPC6表达水平变化通过两次(第一周4 mg·kg-1,第二周2 mg·kg-1)尾静脉（每周第一天）注射阿霉素复制肾病综合征大鼠模型;将造模成功后的大鼠随机分为模型组,氯沙坦（ARB）组(30 mg?kg-1?d-1);观察大鼠的一般状态以及体质量的变化;于给药4周末用代谢笼收集大鼠24 h尿液;麻醉并处死大鼠,取材。BCA法检测24 h尿蛋白含量,全自动生化分析仪检测大鼠血清生化指标BUN,SCr,TG,TC,TP,Alb;HE染色观察肾脏组织形态,透射电镜观察肾脏亚显微结构;放射免疫法检测血浆AngⅡ、钙调神经磷酸酶（Ca N）水平;Western blot检测肾组织TRPC6,AT1R蛋白表达。第二部分当归芍药散对肾病综合征大鼠蛋白尿的干预作用按照上述方法建立肾病综合征大鼠模型,造模成功的大鼠随机分为正常组、模型组、氯沙坦组(30 mg?kg-1?d-1)、当归芍药散（DSS）低、中、高剂量组(4.3,8.6,17.2 g?kg-1?d-1);给药4周后,收集各组大鼠24 h尿液,BCA法检测24 h尿蛋白含量,全自动生化分析仪检测大鼠血清生化指标;HE染色观察肾脏组织形态,透射电镜观察肾脏亚显微结构;放射免疫法检测血浆AngⅡ、Ca N含量;免疫组织化学法检测肾组织AT1R、TRPC6分布情况;Western blot检测肾组织TRPC6,AT1R,Nephrin,Caspase-3蛋白表达。第三部分当归芍药散对AngⅡ诱导的MPC5细胞损伤的保护作用体外培养MPC5细胞株,采用CCK8法筛选刺激因子AngⅡ对MPC5细胞模型的最佳有效时间及浓度,通过AngⅡ刺激MPC5细胞,随机分为正常组,AngⅡ组,AngⅡ+TRPC6特异性抑制剂SAR7334组,AngⅡ+5%DSS含药血清组,AngⅡ+10%DSS含药血清组,AngⅡ+15%DSS含药血清组,Flufenamic acid组;Western blot检测DSS含药血清及flufenamic acid、SAR7334对AngⅡ诱导的MPC5细胞中TRPC6,AT1R,Nephrin,Caspase-3蛋白表达的影响;流式细胞术检测各组细胞凋亡率和胞内钙荧光强度。结果:第一部分肾病综合征蛋白尿大鼠模型的建立及AngⅡ、TRPC6表达水平变化1.大鼠在造模一周后体重开始下降,于造模第4周达到最低值,4周后体重出现回调;ARB组大鼠在给药1周后体重开始回调,给药4周后体重比未干预的肾病综合征大鼠明显改善,且具有统计学差异（P＜0.05）。2.模型组大鼠给药1周24 h尿蛋白含量开始逐渐增加,给药2周后大鼠24 h尿蛋白含量显著升高（P＜0.01）,提示造模成功;ARB组大鼠24 h尿蛋白含量显著降低（P＜0.01）。3.全自动生化分析仪检测显示,模型组大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）显著升高（P＜0.01）,总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）显著下降（P＜0.01）;与模型组比较,ARB组大鼠血清BUN,SCr,TG,TC含量显著降低（P＜0.01）,TP和Alb含量显著升高（P＜0.01）。4.放射免疫法检测结果显示,模型组大鼠血浆中AngⅡ含量显著升高（P＜0.01）;氯沙坦组大鼠血浆中AngⅡ含量显著下降（P＜0.01）。5.肾脏病理检测结果显示,模型组大鼠肾组织病理状态明显,肾小球结构不完整,肾小球基质增生,肾小管细胞广泛出现蛋白样变性;透射电镜下,模型组大鼠足细胞结构出现明显紊乱,足突融合率较正常组显著升高（P＜0.01）;ARB组大鼠肾组织病理损伤较模型组明显减轻（P＜0.01）。6.Western blot实验结果显示,模型组大鼠肾组织中TRPC6,AT1R蛋白表达量显著增加（P＜0.01）;ARB组大鼠肾组织TRPC6,AT1R蛋白表达量显著下降（P＜0.01）。第二部分当归芍药散对肾病综合征大鼠蛋白尿的干预作用1.给药治疗4周后,ARB组和DSS高剂量组大鼠尿蛋白含量,血清BUN,SCr,TG,TC含量显著降低（P＜0.01）,TP和Alb含量显著升高（P＜0.01）。2.放射免疫结果显示,ARB组和DSS各给药组干预的大鼠血浆AngⅡ,Ca N含量均有降低趋势,其中以DSS高剂量组效果最佳（P＜0.01）。3.肾脏HE染色结果显示,模型组大鼠肾组织病理改变同第一部分（P＜0.01）;ARB组和DSS给药组大鼠肾组织病理损伤上述症状较模型组明显减轻（P＜0.01）,其中以DSS高剂量组改善效果最佳（P＜0.01）。4.免疫组化结果显示,正常大鼠肾皮质中TRPC6,AT1R仅在肾小球中有微量表达;模型组大鼠肾皮质中TRPC6分布在整个肾小球狭缝隔膜上,尤其在毛细血管袢外周过表达;同时肾皮质中AT1R表达也显著上调,肾脏皮质、髓质及两者交界处均有阳性表达,且在皮质近端肾小管的细胞质中高表达;与模型组比较,ARB组和DSS各给药组大鼠上述病变较模型组明显减轻。5.Western blot结果显示,模型组大鼠AT1R,TRPC6,Caspase-3蛋白表达量显著升高（P＜0.01）,Nephrin蛋白表达显著下降（P＜0.01）;与模型组比较,ARB组和DSS各给药组大鼠AT1R,TRPC6,Caspase-3蛋白表达量明显降低（P＜0.01）,Nephrin蛋白表达显著升高（P＜0.01）。第三部分当归芍药散对AngⅡ诱导的MPC5细胞损伤的保护作用1.CCK8法检测结果显示,当AngⅡ溶液浓度为1×10-6mol·L-1时,与正常组比较,对足细胞具有明显的抑制作用（P＜0.01）;且细胞形态学观察结果显示,正常足细胞具有绵长的足突,足突之间相互交错联系,AngⅡ干预后足突出现明显的回缩,胞间联系明显变少,提示AngⅡ能被用于足细胞损伤模型的建立。与正常组比较,AngⅡ干预后12 h足突开始出现回缩,24 h出现大范围回缩,48 h后足突几乎全部融合或消失,因此AngⅡ的干预时间设为24 h。。2.AngⅡ组细胞AT1R,TRPC6,Caspase-3蛋白表达显著增加（P＜0.01）,而Nephrin蛋白表达量显著降低（P＜0.01）,同flufenamic acid组基本一致;与AngⅡ组比较,AngⅡ+SAR7334组与DSS各含药血清组细胞AT1R,TRPC6,Caspase-3蛋白表达量显著降低,Nephrin蛋白表达量显著升高（P＜0.01）,且DSS含药血清给药组的改善效果呈剂量依赖型。3.流式细胞术结果显示,AngⅡ组与flufenamic acid组足细胞的凋亡率显著升高,早期凋亡细胞更明显,具有统计学差异（P＜0.01）;且足细胞内钙离子荧光强度显著高于正常组（P＜0.01）,SAR7334组与DSS含药血清组细胞凋亡率及钙荧光轻度均呈现不同程度的降低,且具有显著差异性（P＜0.01）。结论:1.AngⅡ作为肾脏损伤因子,可以诱导TRPC6活化导致足细胞损伤,损伤肾小球滤过屏障结构完整性,参与NS蛋白尿的形成。2.DSS改善肾病综合征大鼠蛋白尿,与阻断AngⅡ-AT1R-TRPC6信号级联,抑制AngⅡ及TRPC6的表达及活化,减少肾小球滤过区域钙离子失衡,从而改善肾小球滤过分子屏障有关。