胶球藻C-169的高通量培养与油脂积累能力的快速评价

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随着化石燃料的日益枯竭和生态环境的不断恶化,世界各国都在努力寻求可再生和环境友好型能源来替代化石燃料。富油微藻(Oleaginous microalgae)能够通过光合作用快速生长,同化CO2合成并积累油脂,油脂含量和面积产率高,藻油可作为制备生物燃料的良好原料,因此富油微藻的开发是节能减排、生产可再生清洁能源的首选。本文以具有较薄细胞壁并已完成全基因组测序的胶球藻Coccomyxa subellipsoidea C-169为研究对象,通过构建均一稳定的高通量培养体系,并采用细胞组学分析技术平台,优化基于荧光染色的油脂含量分析技术,快速评估多种影响因素下胶球藻C-169的生物量增长和油脂积累能力。这对全面掌握胶球藻C-169的基础生物学信息,深入研究其产油机理至关重要。主要研究结果如下:1.在Basal和BBM培养基中通入2%CO2或空气(0.04%CO2)进行光自养培养胶球藻C-169,系统比较了细胞比生长速率、生物量干重、总脂肪酸含量和产率以及中性脂含量的差异。研究表明,在Basal和BBM培养基中补充2%CO2可显著提高细胞比生长速率分别为通入空气的2.6倍和2.3倍。培养13天后,Basal培养基中补充2%CO2情况下可获得最高生物量干重达4.67g/L,显著高于所有其他组(p<0.05);而BBM培养基中补充2%CO2可获得最高总脂肪酸含量达37.53%干重,同时中性脂含量(以荧光强度表示)显著高于所有其他组(p<0.05)。说明在Basal培养基中补充CO2有利于细胞生物量的积累,而在BBM培养基中补充CO2更有利于驱动细胞高产脂肪酸和中性脂。2.采用流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦扫描显微镜等组学分析技术平台,建立了荧光染色测定胶球藻C-169中性脂含量的高通量评价体系,系统研究并优化了藻液细胞浓度、Nile Red浓度、助溶剂种类、DMSO及丙三醇浓度、染色温度、染色时间、振荡时间等对藻细胞中性脂相对含量(以平均荧光强度表示)产生的影响。结果表明,荧光染色的最佳细胞浓度是106/mL,Nile Red染料的最佳浓度范围为0.05~0.2μg/mL,添加15%~30%(v/v)丙三醇能显著改善细胞膜的通透性,25~40℃温度范围内藻细胞的荧光强度较强且无显著差异(p>0.05),染色时间超过10min及振荡时间超过30s均未显著增加胶球藻C-169中性脂的平均荧光强度,经系统优化后可显著提高胶球藻C-169的荧光染色效果。3.通过构建均一稳定的胶球藻C-169高通量培养体系,配合细胞组学分析技术平台,快速评价多种影响因素(氮源种类及浓度、碳酸氢铵和磷酸盐浓度、初始pH值、NaCl浓度等)对藻细胞比生长速率、生物量干重及油脂积累能力的影响。结果表明:富氮培养可显著提高细胞比生长速率和生物量积累,而缺氮培养显著驱动细胞高产中性脂,硝酸钠和尿素是胶球藻C-169生长和油脂积累的最适氮源。当碳酸氢铵浓度为0.23g/L时显著有利于藻细胞生物量积累和油脂合成代谢,增加或降低碳酸氢铵的浓度都会抑制细胞生长和油脂合成。藻细胞对磷源的需求量较小,磷酸盐浓度降低不会显著影响其生物量和中性脂含量。初始pH值为4~6条件下有利于胶球藻C-169的生长和中性脂积累。盐度在0~15‰范围内胶球藻C-169的生长状况良好并无显著差异(p>0.05),15‰以上盐度细胞生长受到显著抑制,其中在10‰盐度条件下有利于驱动细胞高产中性脂,中性脂含量(以平均荧光强度表示)显著高于所有其他组(p<0.05)。
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