背景和目的：马兜铃酸(Aristolochic Acid，AA)隶属于马兜铃属，长期服用AA或含AA的药物可引起患者肾小管坏死，肾间质明显纤维化，进而发展为慢性肾功能衰竭，由此，国内外学者将这类肾脏疾病称之为马兜铃酸肾病(Aristolochic Acid Nephropathy，AAN)[1]。与其他肾脏疾病或中毒性肾病不同，AAN患者表现为肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落，缺乏明显的上皮细胞再生，基底膜裸露，间质弥漫性增宽、进行性纤维化。目前，这些特殊损伤病理表现机制尚不十分清楚，临床治疗更无有效措施，AAN患者常病情迁延不愈，最终进展为终末期肾衰竭[2]。因此，深入探讨AAN肾小管损伤及修复机制是很有必要的。围绕AA的主要及重要靶点——肾小管，国内外学者进行了大量研究，确立了肾小管上皮细胞凋亡[3]、转分化[4]、胞内AA-DNA加合物形成[5]、泌尿系统肿瘤形成[6]等学说，这些学说能解释AAN肾小管毁损的部分病理特点，然肾小管修复不良的原因仍然需要进一步阐明。近年来，肾小管管旁毛细血管(peritubular capillary，PTC)损伤及丢失或内皮细胞损伤[7]在急慢性肾脏疾病，特别是慢性肾脏疾病进展中的作用引起了广大学者的注意[8]。因此，有必要观察AAN过程中，PTC损伤及丢失情况，将其与肾小管损伤及增殖修复不良的关系作一系统分析，并深入研究AA对PTC损伤的细胞生物学毒性机制，以期提出治疗马兜铃酸肾病的新机制和保护治疗新策略。本课题拟通过建立体内动物模型观察PTC损伤及丢失情况，分析该损伤丢失与肾小管损伤、增殖修复的关系，并通过透射电镜进一步观察PTC内皮细胞超微结构改变；体外建立AA对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型，观察AA毒性下内皮细胞增殖、凋亡及迁移、成管等细胞生物学变化，深入研究AA对内皮细胞的损伤机制，以期为临床治疗AAN提供新的损伤机制和治疗策略。方法：本课题拟分为体内、体外两部分进行探讨。第一部分：体内观察AA对PTC的损伤作用及其与肾小管损伤、修复的相关性分析。1. AAN小鼠模型建立。C57/BL/6小鼠分为4组：对照2W组，AA2W组，对照4W组，AA4W组。AA组小鼠以5mg/kg剂量每两天腹腔注射一次AA溶液，对照组注射等体积的缓冲液(PBS)。2.分别于2周、4周时收集小鼠血、尿、肾脏组织，进行血尿生化分析及肾脏病理学观察。3.分析PTC损伤与小鼠肾小管损伤、增殖和修复的相关关系。第二部分：体外研究AA损伤血管内皮细胞的机制。1.采用文献浓度分组[1]，以不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)和不同时间(24h，48h，72h)作用人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)，MTT法检测AA对细胞增殖力的影响，筛选出药物最适作用时间。2. LDH释放：不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)处理HUVEC48h(最佳时间)，检测细胞质LDH释放情况。3.内皮细胞成管：不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)处理HUVEC48h后，收集各组细胞，转种于基质胶包被的96孔板，每孔103~104个细胞，孵育6h后观察细胞成管情况。4.内皮细胞迁移：不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)处理HUVEC48h后，收集各组细胞，按105/孔接种于Transwell小室，下室加入含低浓度血清(2.5%FBS)的DMEM高糖培养基刺激细胞迁移，18~24h后，取出小室，固定染色后倒置显微镜下计数小室下层细胞。5.内皮细胞凋亡：HUVEC经不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)作用48h后，每组收集≥105个细胞，Annexin V-FITC及PI染色后，于流式细胞仪检测细胞凋亡情况。6.线粒体膜电位变化：HUVEC经不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)作用48h后，JC-1染色，激光共聚焦检测细胞线粒体膜电位变化情况。7.线粒体介导的凋亡途径： HUVEC经不同浓度AA(0μg/ml，5g/ml，10g/ml，20g/ml)作用48h后，收集细胞进行western blot实验，观察Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、Apaf-1、Cytochrome C(细胞色素C)表达情况。结果：第一部分：1.经腹腔注射AA的小鼠血Scr、BUN、尿NAG酶较对照组明显升高，其中AA4W较AA2W组更为明显。2. AA组小鼠肾小管损伤、间质纤维化、PTC损伤及丢失情况较对照组明显，其中AA4W较AA2W组更为明显；与AA4W相比，AA2W的小鼠肾小管上皮细胞增殖修复情况较好。相关分析显示PTC丢失量与肾小管损伤积分高度相关，相关关系为正相关(P＜0.05)；与PCNA阳性表达量高度相关，相关关系为负相关(P＜0.05)。3. AA组小鼠PTC内皮细胞中可见线粒体肿胀，部分线粒体脊紊乱、消失。第二部分：1. AA可诱导HUVEC活力降低、LDH释放增加，并呈浓度依赖性。2. AA可导致HUVEC体外成管量减少，成管不完整，且内皮迁移能力下降，两者均呈浓度依赖性。3. AA能诱导HUVEC凋亡，表现为凋亡标记蛋白表达增高(caspase-3、 BAX)、内皮细胞线粒体膜电位下降、线粒体凋亡途径的相关蛋白(Cytochrome C、Apaf-1、Caspase-9)表达上调，而抗凋亡的蛋白Bcl-2表达下调，提示AA可通过线粒体凋亡途径诱导HUVEC凋亡。结论：1. AA能导致小鼠肾PTC损伤及丢失，并随AA作用时间延长，损伤逐渐加重，该损伤与肾小管损伤加重及增殖修复不良高度相关；2. AA能诱导HUVEC增殖抑制、成管抑制、迁移抑制等细胞生物学活动障碍，阻抑内皮细胞损伤时的血管再生，此毒性作用可能影响PTC的修复和功能恢复；3. AA能诱导HUVEC凋亡，该作用可能与AA激活线粒体凋亡途径有关。