【摘 要】
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目的:为了阐明补肾活血方治疗复发性流产（RSA）的可能作用机制。通过蛋白组学技术分析各组间差异表达蛋白,筛选出补肾活血方治疗RSA的有效作用靶点,为进一步研究补肾活血方治疗RSA的分子机制奠定基础。方法:1、收集早孕期（孕4-8周）RSA患者9例,所有的患者都符合纳入标准。对每一位加入实验的受试者的一般信息做出详尽的描述记录。2、治疗方案:RSA患者初诊登记入组后,收集受试者血浆样本,作为药前组（
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目的:为了阐明补肾活血方治疗复发性流产（RSA）的可能作用机制。通过蛋白组学技术分析各组间差异表达蛋白,筛选出补肾活血方治疗RSA的有效作用靶点,为进一步研究补肾活血方治疗RSA的分子机制奠定基础。方法:1、收集早孕期（孕4-8周）RSA患者9例,所有的患者都符合纳入标准。对每一位加入实验的受试者的一般信息做出详尽的描述记录。2、治疗方案:RSA患者初诊登记入组后,收集受试者血浆样本,作为药前组（RSA组）。实验期间根据受试者病情予以补肾活血方加减连续治疗一月,此时收集患者血浆样本作为药后组（RSA-drug组）。随后对受试者进行随访至孕16周,即可正常出组。若患者B超提示异位妊娠、流产,停止用药,出组处理。3、所有受试者采集静脉血3-5m L,带回实验室室温静止30分钟,于4℃条件下以转速1300g-2000g/min离心10分钟,待样本分层后使用移液枪吸取上层血浆于EP管内。再将装有血浆的EP管放于液氮速冻15min处理,随后置于-80℃冰箱保存,待用。4、随后将收集好的血浆样本使用TMT相对定量蛋白组学技术进行质谱实验和生信学分析,过程中主要通过蛋白质的提取和消化、肽断的酶解、TMT标记样品肽段、色谱分级、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）数据的采集和数据库的检索等,我们将获得初始差异蛋白。随后我们将对搜库后的数据进行生物信息学分析,分析内容主要包含了鉴定数量分析、表达差异分析、功能分析和质控分析等。在此过程中我们以表达倍数（Fold Change,FC）＞1.2倍（上调＞1.2倍或下调＜0.83倍）且P value＜0.05（T-test或其他）为准则进行了筛选,并得出了药前与药后具有统计学意义的差异蛋白。并与前期课题组基于蛋白质组学技术筛选的RSA患者组（Abortion组）与正常妊娠组（Control组）的显著差异蛋质结果进行整合分析。我们将筛选后得到的差异表达蛋白质,用Blast2GO软件对GO功能进行注释,随后比较结果,经过Fisher精确检验获得其差异性,最终找到差异表达蛋白中富集的所有功能类别（P＜0.05）。所有被筛选的差异表达蛋白,使用KAAS软件进行KEGG的通路注释,并比较结果,经过Fisher精确检验获得其差异的显著性,随后得出差异表达蛋白质富集的通路类别（P＜0.05）。结果:1、TMT相对定量蛋白质组学结果表明,在RSA组和RSA-drug组之间共筛选出了72个具有差异性表达的蛋白质,其中上调的有42个,下调的有30个。与前期课题组蛋白质组学结果（复发性流产组vs正常妊娠组）整合分析发现了3个补肾活血方治疗RSA的潜在作用靶点:NOTUM、LCN2和PRG2。2、GO功能富集分析显示,在该比较组中关于有丝分裂DNA完整性检查点,参与大分子生物的合成过程的正向调控,染色体的组织,病毒的生命周期,DNA完整性的检查点等重要生物学过程,与核酸结合,脂多糖集合,DNA的结合,RNA的结合,杂环化合物的结合相关等分子功能,细胞内非膜结合细胞器,非膜结合细胞器,膜封闭腔,细胞内细胞器腔,细胞器腔等定位蛋白质,均发生了显著性变化。3、KEGG通路富集分析显示3条补肾活血方治疗RSA潜在的作用通路:结核病相关通路、细胞周期相关通路和Wnt信号通路。结论:1、补肾活血方治疗RSA临床应用满意,能够有效改善患者妊娠结局。2、通过蛋白质组学筛选出了3个潜在的作用靶点,其中PRG2差异最明显,相关资料显示其直接与妊娠相关的滋养层细胞相关,可以促进滋养层细胞的侵袭迁移,我们推测PRG2可能是补肾活血方治疗RSA的主要作用靶点。3、依据KEGG通路的分析结果和相关文献的查阅,Wnt信号通路的改变会影响滋养层细胞的侵袭能力、子宫内膜容受性,两者对正常妊娠的维系至关重要,我们初步推测此通路可能是补肾活血方治疗RSA的主要作用通路。4、通过对知网、万方、维普、Pub Med数据库的检索,暂未发现有NOTUM与流产相关的报道,但已有文献报道其会参与Wnt信号通路的负调控作用,所以我们推测补肾活血方治疗RSA的作用机制中,有可能NOTUM通过参与调控Wnt信号通路来影响滋养层细胞的侵袭能力,进而影响患者妊娠结局。
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