【摘 要】
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目的:通过实时荧光定量PCR法和Western Blot法比较NULL（空白对照组）、NC（阴性对照组-LV8N）、WT（LV8N-Htra1 mus野生）、Het（LV8N-Htra1 mus野生+LV5-Htra1mus突变）、Hom（LV5-Htra1 mus突变）五组细胞TGF-β/Smads信号通路中m RNA、蛋白表达水平,探讨杂合HTRA1基因错义突变（Exon4,c.905G＞A,
【基金项目】
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山西省卫生健康委员会项目“杂合HTRA1基因错义突变（c.905G＞A,p.Arg302Gln）在bEnd.3细胞中的分子机制研究（编号:2020080）”； 山西省科学技术厅面上项目“HTRA1基因下调与过表达对小鼠脑微血管内皮细胞功能影响的研究（编号:202103021224404）”；
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目的:通过实时荧光定量PCR法和Western Blot法比较NULL（空白对照组）、NC（阴性对照组-LV8N）、WT（LV8N-Htra1 mus野生）、Het（LV8N-Htra1 mus野生+LV5-Htra1mus突变）、Hom（LV5-Htra1 mus突变）五组细胞TGF-β/Smads信号通路中m RNA、蛋白表达水平,探讨杂合HTRA1基因错义突变（Exon4,c.905G＞A,p.Arg302Gln）对bEnd.3中TGF-β/Smads信号通路的影响。方法:建立HTRA1基因慢病毒载体感染bEnd.3模型,利用RT-q PCR法检测NULL、NC、WT、Het、Hom五组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达水平;通过Western Blot技术检测NULL、NC、WT、Het、Hom五组细胞中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达水平。结果:依据本课题组前期研究经验构建细胞模型,运用LV8N、LV8N-Htra1 mus野生、LV5-Htra1 mus突变三种慢病毒载体（MOI=125）感染生长状态良好的bEnd.3,选用浓度为5ug/ml的嘌呤霉素筛选,最终成功构建了HTRA1基因过表达慢病毒载体感染bEnd.3稳定株模型。RT-qPCR法检测TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达量可知:NULL组与NC组相比,细胞内TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA表达量均无差别（P＞0.05）;WT与NC组相比,TGF-β1、Smad3、Smad4 m RNA均为上调趋势（P＜0.01）,Smad2 m RNA表达量在两者之间无明显统计学意义（P＞0.05）;Het、Hom组与WT组、NC组相比均为上调趋势（P＜0.01）;对TGF-β1、Smad3而言,其m RNA表达量在Hom组比Het组明显上调（P＜0.01）,Smad2、Smad4 m RNA表达量在Hom组和Het组之间无统计学差异（P＞0.05）。Western Blot法检测Smad2、Smad3、Smad4蛋白水平可知:NULL组与NC组相比,Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达量均无差异（P＞0.05）;WT组与NC组相比,Smad2、Smad3蛋白表达量均有所上调,且具有统计学意义（P＜0.01）,Smad4蛋白表达量在两者之间未见明显差异（P＞0.05）;Het、Hom组与WT组相比,Smad2、Smad3、Smad4蛋白量均有所上调,且具有统计学意义（P＜0.01）,Smad2蛋白分别上调了1.54倍、1.63倍,Smad3蛋白分别增加了1.69倍、1.88倍,Smad4蛋白分别上调了1.89倍、2.05倍;与Het组相比,Smad3蛋白表达量在Hom组明显升高（P＜0.01）,而Smad2、Smad4蛋白表达量在两组之间无明显差异（P＞0.05）。结论:本课题通过构建NULL、NC、WT、Het、Hom五组bEnd.3稳定模型,发现杂合HTRA1基因错义突变（Exon4,c.905G＞A,p.Arg302Gln）可能会导致TGF-β/Smads信号通路中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4 m RNA和蛋白表达量上调,但上调程度小于纯合突变。初步揭示了杂合HTRA1基因在此位点突变对TGF-β/Smads信号通路在转录、翻译水平的影响,为其可能的致病机制研究提供了思路。
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